Bob Matsui besuchte bis 1959 die C.K. McClatchy High School in Sacramento und studierte danach bis 1963 an der University of California in Berkeley. Nach einem anschließenden Jurastudium am Hastings College of the Law in San Francisco und seiner 1966 erfolgten Zulassung als Rechtsanwalt begann er in diesem Beruf zu arbeiten. Gleichzeitig schlug er als Mitglied der Demokratischen Partei eine politische Laufbahn ein. Zwischen 1971 und 1978 saß Matsui im Stadtrat von Sacramento. Außerdem gehörte er einigen weiteren lokalen Gremien an. Im Jahr 1977 war er stellvertretender Bürgermeister von Sacramento.