Leonor fora prometida desde cedo ao príncipe herdeiro de Portugal, o futuro D. João III. Porém, o rei D. Manuel I, que enviuvara pela segunda vez, decidiu casar com ela de forma a tentar uma segunda vez tornar-se rei de toda a Península Ibérica. Na primeira tentativa chegou a ser jurado herdeiro da coroa de Castela através do seu casamento com Isabel de Aragão, mas a morte prematura desta inviabilizou o seu projecto. D. João III nunca irá perdoar o pai por tal desfaçatez.
Em 1518, Leonor, então com vinte anos, tornou-se a terceira mulher do rei D. Manuel I; contudo, em 1521 enviuvou, ficando com dois filhos do enlace. O casamento entre eles foi tratado quando Carlos I de Espanha que fora aclamado imperador do Sacro Império Romano-Germânico (como Carlos V), veio da Flandres a Saragoça, onde reuniu a corte.
D. Manuel I, a pretexto de felicitar o novo imperador, mandou a Saragoça como embaixador seu camareiro, guarda-roupa e armador-mor Álvaro da Costa, para tratar do casamento em segredo. Álvaro da Costa desempenhou-se da missão, a proposta foi bem aceite, as negociações concluídas. Para tratar com o embaixador Álvaro da Costa, foram procuradores: o cardeal Florent, Bispo de Tortosa, futuro papa Adriano VI; Guilherme de Croy, Duque de Sora; e João le Sauvage, senhor de Strambeque. Fez-se um enorme tratado para o casamento, com as obrigações ajustadas. O casamento causou espanto porque o rei de Portugal mostrara-se inconsolável pela morte da segunda esposa, dizendo que abdicava a coroa a favor do seu filho, o futuro D. João III, e se recolhia ao convento de Penha Longa. Foi grande a mágoa do príncipe, que entretanto se apaixonara pela prometida, agora feita madrasta.
Os desposórios realizaram-se em Saragoça em 16 de julho de 1518. Concluídos os contratos, a rainha D. Leonor partiu de Saragoça e entrou em Portugal por Castelo de Vide com fidalgos e particulares, tal como Damião de Góis minuciosamente refere na Crónica de D. Manuel (capítulo 34, parte IV). O rei esperava-a no Crato, e em 24 de novembro ali se celebraram festas. Como em Lisboa havia peste,[desambiguação necessária] os esposos e toda a corte foram para Almeirim, onde se demoraram até ao verão seguinte. Dirigiram-se então para Évora e só voltaram a Lisboa quando extinta a epidemia. Em 21 de janeiro de 1521 a rainha entrou na cidade com pompa e aparato, trazendo já o infante D. Carlos (nascido em Évora a 18 de fevereiro de 1520) que morreria muito cedo. No Paço da Ribeira de Lisboa teve o segundo filho, a infanta D. Maria, em 8 de junho de 1521.
Leonor enviuvou em 13 de dezembro de 1521. Recolheu-se ao convento de Odivelas, mas D. João III não consentiu que se afastasse tanto do paço. Foi então para Xabregas, e começou a levar uma vida de religiosa professa. Ouvia missa diariamente, frequentava os ofícios divinos, vivia com austeridade e mandava acudir às misérias do povo, nomeadamente durante a terrível seca de 1521. D. João III ia visitá-la frequentemente. O seu amor pela madrasta parecia intacto e a viúva parecia mesmo ter certa simpatia por ele. Perante as contínuas visitas, o embaixador de Castela em Lisboa, Cristóvão Barroso, insinuou que já não se tratava de mera cortesia, o que causou preocupação em Castela, onde constava que o povo de Lisboa murmurava e teria mesmo feito representação ao rei e a D. Leonor pedindo que se casassem. Carlos V, que pensava em dispor da mão da irmã de outra forma, opôs-se energicamente, e mandou pedir a D. João III o seu beneplácito para que ela voltasse para Castela. Houve hesitações da parte de Portugal. Insistindo o imperador, porque pensava casar a irmã com o rei de FrançaFrancisco I, D. João III deu o consentimento, e D. Leonor saiu de Portugal em maio de 1530 com os infantes D. Luís e D. Fernando, o Duque de Bragança D. Jaime e outros fidalgos. Ficou em Lisboa sua filha, a infanta D. Maria, que só reveria a mãe no ano em que esta morreu.
Rainha de França
Leonor quase foi casada pelo irmão imperador com Carlos III Duque de Bourbon e condestável de França, mas depois da vitória de Pavia, Carlos V decidiu que casaria com próprio rei Francisco I de Valois, viúvo de Cláudia de França, filha de Luís XII. Foi determinado por cláusula do Tratado de Madrid e de Cambrai. O contrato de Cambrai, ou Paz das Damas, estipulava o casamento de D. Leonor com Francisco I, que foi celebrado a 4 de julho de 1530 na abadia de Capsieux em Baiona. O casamento foi contratado em decorrência do ajuste de pazes entre Francisco I e Carlos V, quando o rei francês estava preso em Espanha após a batalha de Pavia. A infanta viveu a partir de então numa corte voluptuosa, esforçando-se por esquecer na oração e nas obras pias as infidelidades do marido. Sua coroação realizou-se solenemente na Basílica de Saint-Denis em 5 de março de 1531. Acabada a coroação, foram para Paris os cônjuges. Era um casamento unicamente político, para tentar sanar a inimizade tradicional entre Valois e Habsburgos.
Consta ter vivido desgostosa e quase em isolamento; Francisco I entregava-se às suas amantes, Leonor encerrava-se nos seus aposentos, dedicada às suas orações e à leitura da Bíblia. Finalmente, enviuvou em março de 1547 e sem posteridade alguma, pode retirar-se para Flandres, onde estava seu irmão.
Em Espanha
Em 1556, Leonor se recolheu a Talavera la Real, perto de Badajoz. Dez anos mais tarde, em agosto de 1557, quando Carlos V abdicou e se recolheu ao convento de S. Justo, Leonor acompanhou à Espanha sua irmã a Rainha da Hungria, D. Maria. Desde 1557, havia falecido seu antigo noivo, D. João III, ficando a regência entregue à sua viúva D. Catarina da Áustria, também irmã de Leonor. Desejosa de ver a filha Maria, que abandonara em Lisboa, dizendo mesmo que não queria morrer sem a ver, solicitou a graça, e disposta à jornada, veio a Badajoz em 1558, demorou-se ali 20 dias com a infanta D. Maria.
Se pretendia reconciliação ou amor, nada conseguiu pois a infanta D. Maria foi muito fria com a mãe. Leonor adoeceu gravemente, e quinze dias depois da sua retirada, faleceu. O cadáver foi depositado em Mérida, a seis léguas de Taraveruella, e em 4 de fevereiro de 1571 trasladado para o mosteiro do Escorial.
Por mandado de D. Leonor, o mestre Fernando Iarava, seu capelão, havia traduzido e composto em castelhano as Lições de Job, com os Psalmos que se cantam nas Horas dos Finados; e juntamente com as Lamentações de Jeremias os sete Psalmos penitenciais, e os quinze do Canticumgrado, livros de muita raridade, impressos em 1550 e 1556, em Antuérpia por Martim Nucio.
D. Leonor havia escolhido por empresa uma ave fénix ateando com as próprias asas o fogo para mais se abrasar, e por letra as palavras latinas: Unica semper avis.
Maria Antónia, Eleitora da Baviera·Arquiduquesa Maria Ana·Arquiduquesa Cristina·Maria Isabel da Áustria (1680)·Arquiduquesa Maria Isabel·Maria Ana, Rainha de Portugal·Arquiduquesa Maria Teresa da Áustria (1684)·Arquiduquesa Maria Teresa·Arquiduquesa Maria Josefa·Maria Madalena de Áustria·Arquiduquesa Maria Madalena·Arquiduquesa Maria Margarida
Isabel Maria, Princesa de Windisch-Graetz·Helena, Duquesa Filipe de Württemberg**·Rosa, Duquesa Württemberg**·Arquiduquesa Dolores**·Maria Imaculada, Nobile Inigo Neri Sereneri**·Margarida, Marquesa Taliani di Marchio**·Princesa Maria Antónia, Sra. Luis Pérez**·Arquiduquesa Assunta, Sra. Joseph Hopfinger**·Isabel, Condessa de Waldburg-Zeil**·Hedviges, Condessa de Stolberg-Stolberg**·Gertrudes, Condessa de Waldburg-Zeil-Trauchburg**·Arquiduquesa Maria Isabel**·Arquiduquesa Inês**·Arquiduquesa Margarida, Sra. Alexander Cech·Helena, Duquesa de Meclemburgo·Arquiduquesa Ana Teresa·Arquiduquesa Maria Kynga, Sra. Joachim Krist
16ª Geração
Arquiduquesa Adelaide·Carlota, Duquesa de Mecklenburg·Isabel, Princesa Henrique do Liechenstein·Isabel, Nobre Hubert von Braun**·Alice, Baronesa Vittorio Manno**·Maria Antonieta, Baronesa de Proff in Irnich**·Arquiduquesa Marie Cristina**·Arquiduquesa Walburga, Sra. Carlos Tasso**·Arquiduquesa Verena**·Arquiduquesa Catarina, Sra. Roland Huber**·Inês, Baronesa Peter de Fürstenberg**·Maria Ileana, Condessa Adam Kottulinski**·Alexandra, Baronesa Viktor de Baillou**·Maria Madalena, Baronesa de Holzhausen**·Arquiduquesa Isabel, Sra. Friedrich Sandhofer**·Inês, Princesa Carlos Alfredo do Liechenstein**·Arquiduquesa Maria Margarida**·Arquiduquesa Ludovica**·Arquiduquesa Alice**·Josefa, Condessa Clemens de Waldstein-Wartenberg**·Valéria, Margravina de Baden**·Alberta, Baronesa Alexander de Kottwitz-Erdödy**·Teresa, Princesa Rasso da Baviera**·Maria Imaculada, Condessa Reinhart de Hoensbroech**·Arquiduquesa Mónica, Sra. Charles de Rambures·Arquiduquesa Maria Cristina, Sra. Raymond van der Meide·Arquiduquesa Maria, Sra. Wilhelm de Witt·Margarida, Condessa Benedikt of Piatti
17ª Geração
Andreia, Condessa hereditária de Neipperg·Mônica, Duquesa de Santángelo·Micaela, Condessa Hubertus de Kageneck·Arquiduquesa Gabriela, Sra. Christian Meister·Walburga, Condessa Archibald Douglas·Maria Beatriz, Condessa Riprand de Arco-Zinneberg***·Isabel, Condessa Andrea Czarnocki-Lucheschi***·Maria del Pilar, Nobre Vollrad-Joachim von Poschinger·Kinga, Baroneas Wolfgang de Erffa·Arquiduquesa Marie Adelaide, Sra. Jaime Corcuerra·Arquiduquesa Viridis, Sra. Karl Dunning-Gribble·Arquiduquesa Alexandra, Sra. Héctor Riesle·Maria Constança, Princesa de Auersperg-Trautson·Maria Ana, Princesa Peter Galitzine·Catarina, Condessa Maximiliano Secco d'Aragona·Arquiduquesa Isabel, Sra. James Litchfield·Sofia, Princesa de Windisch-Grätz·Arquiduquesa Maria Cristina, Sra. Clemens Guggenberg·Arquiduquesa Maria Bernardete, Sra. Rupert Wolff**·Arquiduquesa Catarina, Sra. Niall Brooks**·Arquiduquesa Alicia**·Arquiduquesa Maria Cristina**·Arquiduquesa Margarida, Sra. Andreas Baumgartner**·Arquiduquesa Maria Valéria, Sra. Martin Josef Wagner**·Arquiduquesa Hedviges**·Arquiduquesa Verónica**·Arquiduquesa Joana·Arquiduquesa Isabel·Arquiduquesa Celina·Arquiduquesa Maria Floriana·Arquiduquesa Sofia·Arquiduquesa Ana Carolina·Arquiduquesa Teresa·Arquiduquesa Sofia·Arquiduquesa Ladislaya
18ª Geração
Arquiduquesa Leonor·Arquiduquesa Glória·Arquiduquesa Sofia·Arquiduquesa Hilda·Arquiduquesa Maria Laura***·Arquiduquesa Luísa Maria***·Arquiduquesa Letícia Maria***·Arquiduquesa Sofia·Arquiduquesa Maria Teresa·Arquiduquesa Margarida·Arquiduquesa Priscilla·Arquiduquesa Maria das Neves·Maria Cristina, Condessa Rodolphe de Limburg-Stirum·Arquiduquesa Gabriela·Arquiduquesa Antónia·Arquiduquesa Isabel·Arquiduquesa Carlota·Arquiduquesa Paulina·Arquiduquesa Lara·Arquiduquesa Tatiana**·Arquiduquesa Anabela**·Arquiduquesa Tara**
19ª Geração
Arquiduquesa Zita·Arquiduquesa Anežka
também infanta de Espanha *também princesa da Toscânia **também princesa da Modena