Romerne etablerte en militær utpost omtrent der byen ligger i dag, som ble kalt Argentoratum. Fra 300-tallet var byen bispesete og på 400-tallet bosatte alemannere, hunere og frankere seg i byen. Den ble i 1262 en del av Det tysk-romerske rike og var et viktig kommersielt senter i middelalderen. Katedralen i Strasbourg ble ferdigstilt i 1439. I 1520-årene var Martin Luther aktiv i Strasbourg, og hans tilhengere etablerte et universitet her i det følgende århundret.
Strasbourg ble annektert av Frankrike i september 1681. Den offisielle intolerante religiøse politikken som førte til at mange franske protestanter flyktet fra Frankrike (mest til Preussen) fikk likevel mindre betydning i Strasbourg, selv om protestanter ble utelukket fra offentlige embeter. Byen fortsatte å være sterkt preget av tysk kultur; på begynnelsen av 1770-årene studerte Goethe her, og byen ble et krystalliseringspunkt for den litterære bevegelsen Sturm und Drang. Med veksten i handel og industri ble byens befolkning tredoblet på 1800-tallet til rundt 150 000.
