עיקר המסכת עוסקת בדיני סוטה. סוטה היא אישה שבעלה חושד בה כי בגדה בו עם גבר מסוים. התהליך מתחיל בקינוי וסתירה. ה'קינוי' הוא התראה שהתרה בה בעלה לבל תיסתר עם גבר זה, ותנאי ה'סתירה' מתקיים על סמך עדות או טענה שנסתרה עם אותו הגבר למשך זמן מסוים, אך לא ידוע כי בגדה בפועל. דיני הסוטה הבסיסיים מפורטים בתורה, בספר במדבר פרק ה'. עיקר הדין הוא כזה: כיוון שאין שני עדים הדרושים להוכחת הבגידה, עורכים לה בדיקה מיוחדת. משקים אותה "מים מרים מאררים", שהם "מים קדושים", קומץ עפר מהמקדש ודיו של מחיקת מגילה מיוחדת שכתובים בה מספר פסוקים מפרשת הסוטה שבספר במדבר. אם האישה לא בגדה, נאמר בתורה, שהיא תקבל שכר רב ותזכה להרות, אך אם בגדה, ירכה נופלת ובטנה מתנפחת. על פי הדין אין חובה על האישה לשתות את המים, אך אם היא מסרבת, עליה להתגרש מבעלה מבלי שתקבל את הכסף הנקוב בכתובה שלה.
לפני שבעלה דורש לבדוק אותה כסוטה, עליו להיות נקי מכל עוון.
מיקומה של המסכת בסדר נשים
הגמרא[3] מציינת כי מיקומה של המסכת אחרי מסכת נזיר הוא על בסיס ברייתא שבה אומר רבי: "למה נסמכה פרשת נזיר שבתורה לפרשת סוטה?[4] לומר לך שכל הרואה סוטה בקלקולה יזיר עצמו מן היין"[3]. על קביעה זו מקשה הגמרא שבתורה ממוקמת פרשת סוטה לפני פרשת נזיר, וכי למה לא הוקדמה המסכת לפני מסכת נזיר? ועונה שמכיוון שבמסכת כתובות בפרק המדיר, נשנו הלכות נדרים, עבר עורך המשנה להלכות נדרים במסכת נדרים, ומהם להלכות נזירות שדומים לנדרים במהותם.
הרמב"ם מציין גם בהקדמתו למשנה כי על המסכת היה להימצא אחרי מסכת גיטין "שעניינה מעניין הגירושין, שהסוטה כשתזנה – יש לכוף האיש והאשה על הגירושין".
היה מביא (שש משניות) - דיני מנחת הסוטה, כתיבת המגילה, שבועת הסוטה.
היה נוטל (שמונה משניות) - הקרבת מנחת הסוטה, השקאת הסוטה, מחיית המגילה ובדיקת המים את הסוטה. במשנה ו' חוזרת המסכת למנחת הסוטה ועוסקת בין השאר בהבדלים בין כהן לכהנת ומתוך דיון זה מפרטת הבדלים שבין איש לאישה בכלל.
ארוסה ושומרת יבם (חמש משניות) - דיני הסוטה בארוסה ושומרת יבם ונשים שאינן שותות או נוטלות את כתובתן, אשת כהן וקינוי בית דין.
כשם שהמים בודקין אותה (חמש משניות) - בדיקת המים את האיש, משניות המתחילות בביטוי "בו ביום" [6].
מי שקינא לאשתו (ארבע משניות) חזרה לדיני עדות בסוטה.
אלו נאמרין בכל לשון (שמונה משניות) - החל מפרק זה ועד סוף המסכת עוסקות המשניות בדברים הטעונים אמירה שיש מהן שנאמרים בכל לשון ויש שנאמרים אלא בלשון הקודש (דוגמת דברי כהן משוח מלחמה שיפורטו בפרק ח' ופרשת עגלה ערופה שתפורט בפרק ט'). יש הסבורים כי עניינים אלו הובאו במסכת על מנת ללמד שפרשת סוטה נאמרת בכל לשון.
משוח מלחמה (שבע משניות) - דברי כהן משוח מלחמה ודיני מלחמה שונים.
עגלה ערופה (חמש עשרה משניות) - ביאור פרטי הדינים של פרשת עגלה ערופה.
ששת הפרקים הראשונים עוסקים בדיני סוטה (כלומר אישה הנחשדת בזנות תחת בעלה). הפרק השביעי דן בהלכות בהם יש לומר נוסח מסוים (כמו פרשת סוטה), ובשאלה האם הנוסח צריך להיאמר דווקא בלשון הקודש או מותר לאומרו בכל לשון. הפרק השמיני דן בהלכות מלחמה והתשיעי בהלכות עגלה ערופה.
^מספר המשניות בכל פרק הוא לפי הספירה במשניות קהתי. בדפוסים אחרים תיתכן חלוקה שונה.
^כל מקום שנאמר במשנה "בו ביום", פירושו: ביום שמינו את רבי אלעזר בן עזריה לנשיא בישיבה ביבנה, שכל זמן שהיה רבן גמליאל נשיא, היה מכריז ואומר: "כל תלמיד חכם שאין תוכו כברו, אל ייכנס לבית המדרש", וכשנתמנה רבי אלעזר בן עזריה לנשיא, ניתנה רשות לכל התלמידים להיכנס לבית המדרש, ומתוך שרבו התלמידים, רב החידוד והפלפול, ולא הייתה הלכה תלויה בספק בבית המדרש.
