윤진서는 1983년 8월 5일 서울에서 1남 2녀 중 차녀로 태어나, 구일초등학교, 신서중학교, 양천여자고등학교를 거쳐 서울예대 연극과를 졸업했다.[1] 그녀는 가정 환경에 대해 2013년 발간한 산문집에서 “아버지에게 사랑을 받으며 자라는 또래 아이들이 나는 늘 부러웠다.”,[2] “난 아버지랑 같이 살지 못”했다,[3] “행복하고 따뜻했던 가정은 아니었”다고[4] 쓰고 있다.
윤진서는 고등학교 시절 단짝 친구들과 떨어지기 싫어 인원제한이 없던 연극부에 가입해서 활동했다.[5] 고등학교 2학년[주 1] 여름방학 때 상명대학교가 주최한 고등학생을 위한 영화교육 프로그램에 참가하였는데, 그곳에서 만난 친구들을 통해 유럽 영화를 접하고 흠뻑 빠지게 되었다. 그녀는 “지금까지 경험해 보지 못한 영화의 신세계에 나는 홀딱 빠져버렸고, 아직도 세상엔 재미있고 훌륭한 영화들이 많으며, 내가 본 영화는 그중 천분의 일도 채 되지 않음을 실감했다.”고 밝혔다.[6] 윤진서는 이후 고등학교 3학년 때인 2001년 영화 《버스, 정류장》에 오디션을 거쳐 단역(여학생3)으로 캐스팅돼 출연하면서 영화계에 발을 들여놓게 되는데(개봉은 2002년),[7] 2008년 필름2.0과의 인터뷰에서 왜 배우가 됐냐는 질문에 “고등학교 2학년 때 단편영화를 연출해본 경험이 있다. (...) 배우로 한 학년 아래 후배를 캐스팅했는데 연기가 너무 답답한 거다. 자꾸 예쁘게만 보이려고 하는 거다. (...) 뭔가 말로 설명할 수 없는 아우라가 함께 있었으면 했다. 그래서 차라리 내가 연기를 해봐야겠다고 마음먹었다. 나는 미인이 아니니까 영화에서 예쁘게만 보이지 않을 거라는 이상한 자신감 같은 것이 있었다.”라고 말하였다.[8]
단역과 단편영화 출연 경력이 전부였던 신인 배우 윤진서는 2003년 11월 개봉한 박찬욱 감독의 화제작 《올드보이》에 출연하면서 처음 주목을 받았다. 이 영화는 윤진서가 이름이 있는 배역으로 출연한 첫 작품으로, 그녀는 조연이긴 하나 중요한 역할인 이우진(유연석/유지태 분)의 누나 이수아를 연기했다.[9][10] 윤진서는 이 작품에서 신비하고 순수한 이미지를 선보이며 주목을 받았고,[11][12] 2004년 백상예술대상 영화부문 여자 신인연기상을 수상하였다.[13] 윤진서는 《올드보이》가 개봉한 다음 달인 2003년 12월 류승범과 같이 출연한 MBC의 5분 드라마인 《한뼘드라마》 〈크리스마스의 연인〉 편을 통해 텔레비전에도 얼굴을 비추었다.[14]
다음 해인 2004년 초 윤진서는 서태지의 7집 《7th Issue》 수록곡인 〈로보트〉와 〈Heffy End〉 및 〈Live Wire〉의 뮤직비디오에 출연하였다.[15][16] 같은 해 9월 개봉한 야구를 소재로 한 영화 《슈퍼스타 감사용》에서는 야구장 직원 박은아 역으로 출연해 감사용(이범수 분)과의 로맨스를 연기했다.[10] 그녀는 《슈퍼스타 감사용》에 출연한 이후 발음 교정의 필요성을 느껴 성우에게 발성과 발음을 교습받았다.[17] 윤진서는 이 해 영화 잡지 프리미어가 영화 관계자들을 대상으로 한 설문조사에서 과대평가된 여자배우에 1위인 전지현에 이어 2위에 뽑히기도 했다.[18] 이후 2005년 10월 개봉한 일곱 남녀의 사랑을 그린 로맨스 영화 《내 생애 가장 아름다운 일주일》에서 꽃미남 가수를 짝사랑하는 예비수녀 임수경을 연기했는데,[19] “평범한 캐릭터보다는 영화적인 캐릭터를 해보고 싶”어 이 작품을 선택했다고 말했다.[20] 같은 해 11월 개봉한 《사랑해, 말순씨》에서는 극중 광호(이재응 분)가 짝사랑하는 옆방 누나 은숙을 연기했다.[21][22]
윤진서는 2007년 개봉한 불륜을 소재로 한 영화 《바람 피기 좋은 날》에 김혜수, 이민기, 이종혁과 함께 출연해 이종혁(여우 두 마리 역)의 상대역인 내숭쟁이 주부 작은 새를 연기했고,[23] 만화가 강경옥의 동명 만화를 원작으로 한 공포영화 《두 사람이다》에서 주변 사람들의 살해 시도에 시달리는 고등학생 김가인을 연기했다.[24]
