Игра на позицији дефанзивног везног играча, као и његов саиграч Гатузо. Каријеру је започео као играч Чезене већ са 17 година, у сезони 1994/95. Након неколико одличних партија привукао је пажњу тадашњег тренера Милана Фабија Капела који га је довео у дрес Росонера већ следеће године. Због јаке конкуренције у тиму Милана послат је на позајмицу Виченци у којој је био један од најбољих играча. Вићенца је те године изборила опстанак у Серији А. Године 1999, Амброзини је по повратку на Сан Сиро успео изборити место у првом тиму.
Пропустио је већи део сезоне 2002/03. због тешке повреде колена. У финалу Лиге шампиона на Олд Трафорду је ушао тек у 87. минуту уместо Руја Коште.
Временом је због слабије форме, узроковане низом повреда, изгубио статус првотимца, улазећи као замена за Гатуза. Са Миланом има уговор до 2010. године.
