University of Illinois i Urbana-Champaign Cornell University (–1947) (akademisk grad: ph.d., studieretning: organisk kjemi) Urbana High School Weill Cornell Medicine
Holley ble født i Urbana, Illinois, og ble uteksaminert fra Urbana High School i 1938. Han fortsatte med å studere kjemi ved University of Illinois i Urbana-Champaign, derfra ble han uteksaminert i 1942, hvorpå han startet på sine doktorgradsstudier innen organisk kjemi ved Cornell University. Under andre verdenskrig arbeidet Holley under professor Vincent du Vigneaud ved Cornell University Medical College, hvor han blant annet var involvert i den første kjemiske syntese av penicillin. Holley fullførte sine doktorgradsstudier i 1947.
Etter hans diplomstudium forble Holley assosiert med Cornell Universoty, da han ble ansatt som amanuensis i organisk kjemi i 1948, og han ble utnevnt som professor i biokjemi i 1962. Han begynte sin forskning ved dette universitetet etter å ha tilbrakt ett sabbatsår (1955–1956) da han studerte sammen med forskeren James F. Bonner ved California Institute of Technology. I 1968 ble Holley tildelt et stipendiat ved Salk Institute for Biological Studies i La Jolla, California.