Si forma nei conservatori di Perugia e di Bologna. Ancor prima di diplomarsi diviene assistente di Arturo Toscanini (1907-1909) e per un breve periodo di Gino Marinuzzi. Molto attivo in Argentina, dove si reca di frequente fra il 1910 e il 1914, è per alcuni anni uno dei direttori più quotati del Teatro Colón di Buenos Aires, imponendosi all'attenzione del grande pubblico e della critica in opere verdiane e della scuola verista (Mascagni e Giordano in particolare).
Nel 1924 Arturo Toscanini, che, come già segnalato, lo aveva avuto molti anni prima come assistente e che nutre per lui grande stima, lo chiama alla Scala. Gabriele Santini dirigerà, nelle stagioni 1924-1929, numerose opere soprattutto del repertorio verdiano e della giovane scuola italiana, fra cui Macbeth, Il trovatore, Aida, Madama Butterfly (memorabile la rappresentazione del 12 maggio 1928 con Rosetta Pampanini e Antonio Melandri), Tosca (restate nell'albo d'oro scaligero le rappresentazioni dell'aprile 1928 con Gilda Dalla Rizza, Aureliano Pertile e Mariano Stabile) e molte altre. Poche settimane prima di lasciare Milano per Roma dirige, 19 febbraio 1929, la prima scaligera de L'Heure espagnole di Maurice Ravel; fra gli interpreti il soprano spagnolo Conchita Supervía e il basso Salvatore Baccaloni. La tiepida accoglienza ricevuta dalla stessa opera tre anni prima a Torino si trasforma alla Scala, grazie anche alla direzione di Santini, in un autentico trionfo.
L'incontro successivo avviene nella stagione lirica romana1952-1953 con una Traviata (il 15, 18 e 21 gennaio 1953, con Francesco Albanese e Ugo Savarese), che riscuote un successo eccezionale. Nel settembre di quello stesso anno la RAI convoca a Torino Gabriele Santini e gli stessi interpreti per l'incisione su disco. A detta di molti critici sarà un delle migliori edizioni discografiche dell'opera. Scrive in proposito Paolo Isotta, critico musicale del Corriere della Sera:
«...La traviata... modello per tutti i tempi a venire è quella diretta con l'orchestra EIAR di Torino nel 1953 da Gabriele Santini il quale impone la disciplina musicale a Maria Callas, poche volte altrettanto grande... Dopo sono venuti Georges Prêtre, Carlos Kleiber e Riccardo Muti[1]»
Sull'onda del successo di Traviata, Santini torna a dirigere la Callas ancora nel 1953 a Roma, prima in Norma, con Franco Corelli e Fedora Barbieri e successivamente nel Trovatore, in cui il soprano greco-americano è affiancato nelle tre rappresentazioni (16, 19 e 23 dicembre 1953) da un cast d'eccezione: Lauri-Volpi, la Barbieri e Paolo Silveri. Anche questa volta non mancherà un grande successo di critica e di pubblico, che si ripeterà due anni più tardi in occasione della Medea, interpretata, oltre che dalla Callas, da Francesco Albanese, la Barbieri, Boris Christoff e Gabriella Tucci.
I destini umani e artistici di Gabriele Santini e Maria Callas si incrociano per l'ultima volta al Teatro dell'Opera di Roma il 2 gennaio 1958, in occasione di un nuovo allestimento di Norma. È presente il presidente Giovanni Gronchi e c'è molta attesa fra il pubblico. Quanto accade in quella memorabile serata sarà oggetto di discussione fino ai giorni nostri. La Callas si rifiuta di cantare dopo il primo atto dell'opera per motivi mai del tutto chiariti. L'Italia tutta interpreta questo rifiuto come un'offesa arrecata al paese nella persona del suo presidente e il soprano greco non verrà più invitata a cantare a Roma. Gabriele Santini si rifiuterà successivamente di dare un giudizio personale sull'accaduto, ma un anno e mezzo più tardi, quando verrà invitato a dirigere presso la Royal Opera House di Londra un concerto della Callas, opporrà un cortese rifiuto.
Negli ultimi anni di carriera, pur non abbandonando completamente la conduzione orchestrale in teatro, si dedica soprattutto alle incisioni discografiche.
Nel 1962, ormai settantaseienne, rinuncia all'incarico di primo direttore d'orchestra e direttore musicale del Teatro dell'Opera di Roma.
Nel 1964, avvalendosi ancora una volta dell'orchestra del Teatro dell'Opera di Roma, registra per la EMI Andrea Chénier, di Umberto Giordano, con Antonietta Stella e Franco Corelli. Il 12 aprile dello stesso anno dà l'addio alle scene dirigendo alla Scala, con grande successo, ancora il Don Carlo.
Nella prima settimana di novembre del 1964 inizia a Roma l'incisione di Tosca, ma pochi giorni viene colto da un ictus e, ricoverato in una clinica della capitale, si spegne il giorno 13.
Su Gabriele Santini un ritratto completo ne "La virtù dell'elefante" di Paolo Isotta (per il quale la Traviata da lui diretta è la migliore mai incisa) uscito nel 2014 (Marsilio): Anche in "Altri canti di Marte" (2015) lo storico della musica annovera Santini fra i più grandi direttori da lui ascoltati.
Manon Lescaut di Giacomo Puccini; Orchestra e coro del Teatro di San Carlo, di Napoli; Floriana Cavalli (Manon), Carlo Bergonzi (Des Grieux), Giuseppe Valdengo (Lescaut), Mariano Caruso (Edmondo), Antonio Cassinelli (Geronte) - 1964, registrazione dal vivo, Bongiovanni