Bár Eleonóra többre tartotta a kolostori életet a bécsi császári udvar pompájánál, családja nyomására elfogadta I. Lipót császár házassági ajánlatát, aki ekkorra már kétszer özvegyült meg. 1676. december 14-énPassauban ment férjhez Lipóthoz, 1681. november 9-énSopronban magyar királynévá, majd 1689-ben Mainzban német-római császárnévá koronázták. A rendkívül művelt asszony lett Lipót egyik legfontosabb segítője, s erős befolyást gyakorolt a politikára és az udvari életre. 1686 és 1705 között a Gonzaga Eleonóra királyné által alapított Csillagkeresztes Rend védnökasszonya volt, ami a katolikus, jótékonykodó nemes asszonyok kitüntetése és szervezete volt.
Özvegységben
I. Lipót 1705. május 5-énBécsben meghalt. Eleonóra 15 évvel élte túl férjét, és a császár halála után az udvar befolyásos központja maradt, nem tartott attól, hogy kritizálja fia, I. József császár kormányzati tevékenységét.
Egész életében nagy vallási jámborsággal szentelte magát a szegények és betegek gyámolításának.
Egy gyónás közben szélütést kapott, és néhány hét múlva, 1720. január 19-én meghalt. Saját kérésére nem boncolták fel, és nem balzsamozták be. Egyszerű apácaruhában helyezték örök nyugalomra a Habsburgok hagyományos temetkezőhelyén, a bécsikapucinusok templomának kriptájában.