CRISPR gene-edizio

CRISPR-Cas9 sistema

CRISPR gene-edizioa (CRISPR, ingelesetik "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats", erregularki taldekatutako eta interespaziatutako sekuentzia palindromiko errepikakor laburrak) biologia molekularrean erabiltzen den ingeniaritza genetikoko teknika bat da, zeinaren bidez izaki bizidunen genomak alda daitezkeen. Bakterioen CRISPR-Cas9 oinarritzen da defentsa-sistema antibiralaren bertsio sinplifikatuan. Cas9 nukleasa RNA gidari (gRNA) sintetiko batekin elkartzean sortutako konplexua zelula batean barneratzean, zelularen genoma moztu egin daiteke desiratutako lekuan, eta horrela posible egin dagoeneko existitzen diren geneak in vivo kentzea edota gene berriak txertatzea.[1]

Guraize genetiko gisa lan eginez, Cas9 nukleasak DNAren itu-sekuentziaren bi harizpiak irekitzen ditu aldaketa sartzeko. Knock-in mutazioak egitea da, homologian oinarritutako konponketaren bidez (HDR), edizio genomikoan erabilitako bide tradizionala.[1] Horri esker, DNAn kalte espezifikoak sartzen dira eta konponketa egiten da. Beraz, CRISPR-Cas9-ren ingeniaritza genomikoak zorizko geneen mozketa selektiboak egiteko gaitasuna ematen die ikertzaileei.

Laurogeiko hamarkadatik genoma-edizioa posiblea izan bada ere zelula eukariotoetan hainbat metodo erabilita, erabilitako metodoek erakutsi zuten ez zirela eraginkorrak ezta praktikoak eskala handian ezartzeko. CRISPRaren eta, zehazki, Cas9 nukleasa-molekularen aurkikuntzarekin, posiblea bihurtu zen edizio eraginkorra eta oso selektiboa egitea. Streptococcus pyogenes bakterio-espezietik eratorritako Cas9-ak erraztu du zelula eukariotoetan zuzendutako aldaketa genomikoa, ahalbidetzen baitu crRNA eta tracrRNA gida-kateek izendatutako kokapen espezifiko batean haustura espezifiko bat sortzeko metodo fidagarri bat.[2] Cas9 nukleasaren aldaera berriak garatu dira, off-target (ituz kanpoko) jarduera nabarmen murrizten dutenak.[3]

CRISPR teknika oso garrantzitsua da bioteknologian eta medikuntzan, genomak in vivo modu oso zehatz, merke eta errazean editatzeko ematen baitu aukera. Erabil daiteke sendagai, nekazaritza-produktu eta genetikoki eraldatutako organismo berriak sortzeko, edo patogenoak eta izurriteak kontrolatzeko baliabide gisa. Gaixotasun genetiko hereditarioen tratamenduan ere erabili izan da, baita mutazio somatikoetatik eratorritako gaixotasunetan ere, minbizia kasu. Hala ere, kezka bioetiko asko azaldu dira CRISPR teknika lerro germinalen ediziorako erabiltzeko aukeraren inguruan, bereziki giza enbrioietan. Teknikaren garapenari esker, Jennifer Doudnak eta  Emmanuelle Charpentierrek Kimikako Nobel saria jaso zuten 2020an.[4][5]

Ingeniaritza genomikoa

Cas proteinen sailkapena

Gaur egun, CRISPR sistemak 6 mota dituzten bi klase handitan banatzen dira: 1. Klasea (I, III eta IV motak) eta 2. Klasea (II, V eta VI motak). I. motako sistema da bakterioetan gehien hedatuta dagoena, eta crRNAri lotuz konplexu multiproteiko bat eratuta bereizten dena, “babes antibiraleko CRISPRari lotutako konplexu” edo “Cascade” izenez ezaguna. Konplexu horrek DNA sekuentzia inbaditzaileak ezagutzen ditu eta Cas3 nukleasa bat erreklutatzen du dagokion mozketa egiteko. III. motako sistemak interferentziarako multi-Cas-proteina konplexuak (Csm) erabiltzen ditu. II. motako sisteman, Cas9 nukleasak tracrRNAren beharra du crRNArekin osatzeko eta, heltzean, itu-DNAren hiru nukleotidoren PAM sekuentzia ezagutzen du. V sisteman, Cas12 da proteina efektore bereizgarria. II. motako sistemetan bezala, V sistemen azpimota batzuek tracrRNA behar dute crRNAren heltzerako eta interferentziarako. Azkenik, VI. motako sistemak Cas13 proteina erabiltzen du, itu-RNArekin lotzean aktibatzen den RNAsa bat, itu-RNA zein alboko RNA degradatzen dituena. PAM gune bat ezagutzen duten beste Cas proteinek ez bezala, Cas13-k RNA inbaditzailean protobanatzailearen (PFS) alboko gune bat ezagutzen du.[6]

II. motako sistema da organismoen genomak editatzeko tresna molekular gisa gehien erabiltzen dena. Sistema horrek Cas9 nukleasa du, crRNAk gidatuta DNAn kate bikoitzeko ebakiak sortzen dituen entzima.[6]

Mota Efektorea Nukleasa Itua tracrRNA beharra
1. Klasea I Multiproteikoa Cas3 DNA Ez
III Cas10 DNA/RNA Ez
IV ? ? ?
2. Klasea II Proteina hainbat domeinurekin Cas9 DNA Bai
V Cas12 DNA Azpimota batzuk
VI Cas13 RNA Ez

CRISPR-Cas9 sistema

Oinarrizko osagaiak

CRISPR-Cas9-k II motako CRISPR sistema erabiltzen du, hau da, DNA mozten duen sistema Cas9 nukleasa erabiliz. Sistema hau erribonukleoproteina batez osatuta dago, crRNA, tracrRNA, Cas9 nukleasa eta DNA konpoketa-txantiloi bat dituena.

crRNA DNA ostalariaren segmentu zuzena aurkitzen duen RNA gidaria dauka, tracRNAri lotzen zaion eskualde batekin batera (normalean begizta formakoa), konplexu aktiboa osatzen duena.
tracrRNA cRNArekin bat egiten du eta konplexu aktibo bat osatzen du.
sgRNA “Single-guide” RNAk crRNA batez, gutxienez, eta tracrRNAz osatutako RNA elkartuak dira.
Cas9 Entzima honen forma aktiboa DNA eraldatzeko gai da. Funtzio ezberdinak dituzten aldaera asko daude, entzima bakoitza DNA eskualde jakin bat ezagutzeko gai delako.
Konponketa-txantiloia Ostalariaren zelulan txantiloi gisa erabiltzen den DNA molekula da. Horri esker, DNA sekuentzia espezifikoa txerta daiteke Cas9-k apurtutako DNA ostalariaren eskualdean. Osagai hau hautazkoa da.
DNAren konponketa kate bikoitzeko haustura eta gero

CRISPR-Cas9 teknikan askotan erabiltzen dira erribonukleoproteinaren osagaiak kodetzen dituzten plasmidoak, osagai hauek itu-zeluletara transfektatu ditzaten; edo erribonukleoproteina muntatu egiten da, nukleofekzio bidez zeluletan sartu aurretik.[7] Plasmido honen osagai nagusiak taulan zerrendatu dira. crRNA aplikazio bakoitzerako modu espezifikoan diseinatzen da, hori baita Cas9-k zelula ostalariaren DNAren sekuentzia espezifikoak identifikatzeko eta horiei batzeko erabiltzen duen sekuentzia. crRNA soilik batu behar da editatu nahi diren sekuentzietan. Konponketa-txantiloia ere aplikazio bakoitzerako espezifikoki diseinatuta dago; izan ere, nolabaiteko osagarritasuna izan behar du ebaketaren alde bakoitzeko DNA sekuentziekin. Gainera, ostalariaren genoman txertatu nahi den edozein sekuentzia eduki behar du bere baitan.

crRNA eta tracrRNA asko paketatu daitezke “single-guide” RNA (sgRNA) bakarra sortzeko.[8] sgRNA hori Cas9 proteina kodetzen duen genearekin batera sar daiteke eta plasmidoan txertatua izan, zeluletan transfektatua izateko. Tresna online asko eskuragarri daude sgRNA sekuentzia eraginkorrak diseinatzen laguntzeko.[9][10]

CRISPR-Cas9 plasmidoaren eraikuntzaren ikuspegi orokorra
Egitura

CRISPR-Cas9-k fideltasun maila handia eta eraikuntza nahiko sinplea eskaintzen ditu. Bi faktoreren menpe dago bere espezifikotasunerako: itu-sekuentzia eta ondoko motibo protobanatzailearen (PAM) sekuentzia. Itu-sekuentziak 20 baseko luzera du CRISPR locus bakoitzaren zati gisa.[7] Cas9 proteinek ostalariaren genoman kokapen egokia aukeratzen dute ostalariaren DNAn base-pareekin elkartzeko sekuentzia erabiliz. Sekuentzia ez da Cas9 proteinaren parte eta, ondorioz, pertsonalizagarria da eta modu independentean sintetizatu daiteke.[11][12]

PAM sekuentzia ostalariaren genoman Cas9-ren bidez ezagutzen da. Cas9 ezin da erraz aldatu PAM sekuentzia desberdin bat ezagutzeko. Dena den, hori azken finean ez da mugatzaileegia, normalean genoman zehar leku askotan gertatzen den sekuentzia oso laburra eta inespezifikoa izaten baita.[7]

Sekuentzia horiek plasmido batean muntatu eta zeluletan transfektatu ondoren, Cas9 proteinak, crRNAren laguntzaz, sekuentzia zuzena aurkitzen du zelula-ostalariaren DNAn eta, Cas9 aldaeraren arabera, harizpi bakarreko edo bikoitzeko haustura bat sortzen du DNAren kokapen egokian.[13]

DNA ostalarian behar bezala tartekatutako haustura monokatenarioek homologiak zuzendutako konponketa eragin dezakete, haustura bikatenario baten ondoren gertatzen den mutur ez-homologoen elkarketak baino akats gutxiago egiteko joera duena.[7] DNA konpontzeko txantiloi bat emateak DNA sekuentzia espezifiko bat genomaren barruko kokapen zehatz batean txertatzea ahalbidetzen du. Konponketa-moldeak 40 eta 90 base-pare artean izan behar ditu, Cas9-k eragindako DNA hausturatik harago. Helburua da zelularen jatorrizko HDR prozesuak emandako konponketa-txantiloia erabiltzea eta, horrela, sekuentzia berria genoman txertatzea. Behin gehituta, sekuentzia berri hori zelularen material genetikoaren zati bat izango da , eta zelula-alabetara pasatzen da.[14]

Metodoak

Knock-out baten eraketa

Gene edo eskualde genomiko baten funtzioaren ezabapena mutazioak sortzean edo sekuentzia interesgarriak mugitzean lortzen da, Cas9 edo Cas12 nukleasa eta sgRNA bat erabiliz, azken honek nukleasa ebaketa-gune zehatz baterantz gidatu duela. Ebaketaren konponketa organismoaren gaitasunaren araberakoa izango da; hala ere, konponketa-prozesuan mutazioak edo delezioak sar daitezke eta, ondorioz, funtzioa galdu eta knockout (Ko) bat sortu. Mutazio-mota horren bidez, funtzioren bat duten eskualde kodifikatzaileen eta eskualde ez-kodifikatzaileen funtzioa identifika daiteke.[6]

Genomak editatzea multiplex integrazioaren bidez

Banakako ikuspegiak muga garrantzitsuak dakartza CRISPR sistemen eraginkortasunari eta aplikazio bioteknologikoei dagokienez; izan ere, askotan, eskualde genomiko ugari editatu behar dira zenbait gene aldatzeko eta sartzeko. Banakako edizio-prozesua hainbat aldiz errepikatzea ez dirudi egokiena denik; zorionez, CRISPR/Cas9 edizio genetikoaren sistemak badu abantaila bat: genomaren eskualde anitz editatzen ditu eraldaketa bakar batean, edizio genetikoko beste sistema batzuek ez bezala, Cas9 proteinarekin batera hainbat gRNA ezberdin ezarriz. Multiplex teknologia aplikatzen duten lan gehienak oinarritzen dira mutazio puntualak sortzea edo espezifikoki gene anitz desaktibatzea bilatzen duten adierazpen-bektoreen prestaketan. Hala ere, helburu batzuetarako komenigarria da multiplex konstruktua lan egin nahi den organismoaren genoman integratzea. Integrazio genomiko hori egiteko hainbat estrategia metodologiko daude, baina zientzialariek CRISPR/Cas sisteman oinarritutako edizio-sistema erabiltzea erabaki dute, ikuspegi sinpleagoa, merkeagoa, moldakorragoa eta arrakasta-tasa handiagokoa ematen duelako.[6]

Interferentziazko edo aktibaziozko CRISPR bidezko transkripzioaren erregulazioa

Gaur egun, gene baten adierazpena modulatu daiteke Cas9 inaktibo bat eta sgRNA egoki bat erabiliz. Horiek, oro har, modu espezifikoan eragina dute transkripzio-elongazioko prozesuetan, RNA polimerasen loturan edo transkripzio-faktoreetan. Cas9-k nukleasa gisa funtzionatzeko duen ezintasun hori (dCas9 edo Dead Cas9) sortzen da RuvC eta HNH domeinuetan, zeintzuek DNAren kate bikoitzean mozketaren eragileak diren, gertatzen diren bi mutazio puntualen ondorioz. Horrek Cas9-k DNAn mozketak egitea galarazten du, genoman leku espezifiko batera zuzentzeko gaitasuna galdu gabe. dCas9 gene baten sustatzailera zuzentzeak RNA polimerasaren makineria fisikoki blokea dezakeela ikusi da eta, ondorioz, transkripzioa oztopatu eta ezabatu. Tresna horri CRISPR interference (CRISPRi) deritzo. Aldiz, CRISPR activation (CRISPRa) tresnak dCas9-rekin fusionatutako transkripzio aktibatzaile bat erabiltzen du, itu-genearen adierazpena handitzen duena.[6]

Edizio genetikoa CRISPR Nickaseren bidez

Cas9 nukleasak nukleasa-jarduera duten bi domeinu aktibo ditu (HNH eta RuvC). HNH domeinuak itu-sekuentzia duen DNAren harizpia mozten du, hau da, sgRNArekiko osagarria izango den katea, eta RuvC domeinuak, berriz, DNAren beste harizpia. Bi domeinuetako batean mutazioak egiten direnean, Cas9-k ebakiak egiten ditu DNAren kate bakar batean; aldaera horri Cas9 nickasa (nCas9) deitzen zaio. Beraz, bi domeinuek aktibo egon behar dute DNAn kate bikoitzeko ebakiak eragiteko.[6]

Aplikazioak biomedikuntzan

Biomedikuntza

CRISPR-Cas teknologia giza gaixotasun askotarako tratamendu gisa proposatu da, batez ere kausa genetiko bat duten gaixotasunetarako.[15] DNA-sekuentzia espezifikoak aldatzeko duen gaitasunak bihurtzen du gaixotasuna eragiten duten mutazioak zuzentzeko ahalmena duen tresna. Animalia-ereduetan egindako aurretiazko ikerketak iradokitzen du CRISPR teknologian oinarritutako terapiek gaixotasun mota ugari tratatzeko ahalmena dutela,[16] barne direla minbizia,[17] progeria,[18] beta-talasemia,[19][20][21] anemia faltziformea,[21][22] hemofilia,[23] fibrosi kistikoa,[24] Duchenneren distrofia muskularra,[25] Huntingtonen gaixotasuna,[26][27] amiloidosi transtinikoa eta bihotzeko gaixotasuna[28]. Eltxoetan malaria sendatzeko ere erabili izan da CRISPR, eta horrek bektorea eta gaixotasuna desagerraraz litzake gizakiengan.[29] CRISPRek ehun-ingeniaritzan eta birsortze-medikuntzan ere izan ditzake aplikazioak; adibidez, II. motako MHC proteinen adierazpenik ez duten giza odol-hodiak sortzeko, askotan uko egiten baitiote transplanteari.[30]

Gainera, CRISPR-Cas9 teknologia erabiliz giza pazienteetan beta-talasemia eta anemia faltziformea sendatzeko egin diren saiakuntza klinikoek etorkizun handiko emaitzak erakutsi dituzte.[31][32]

Hala ere, oraindik ere muga batzuk daude terapia genikoan teknologiaren erabileran: efektuaren maiztasun erlatiboki altua helburutik kanpo, PAM sekuentzia baten eskakizuna itu-gunetik gertu, CRISPRek eragindako kate bikoitzeko hausturengatik p53 bitarteko apoptosia eta birusek eragindako ohiko askapen sistemaren ondoriozko toxikotasun immunogenikoa.[33]

Minbizia

CRISPRek aplikazio asko aurkitu ditu zeluletan oinarritutako immunoterapien garapenean ere.[34] CRISPR bidezko lehen entsegu klinikoa 2016an hasi zen. Hartan biriketako minbizia zuten pertsonen immunitate-zelulak hartu ziren, CRISPR erabiliz adierazitako PD-1 genea editatzeko, eta, ondoren, alteratutako zelulak berriro pertsona berari emateko. Beste 20 entsegu bidean edo ia prest zeuden, batez ere Txinan, 2017tik aurrera.[17]

2020ko azaroan, animalia-eredu gisa sagua erabiliz, CRISPR modu eraginkorrean erabili zen glioblastoma (hazkunde azkarreko garuneko tumorea) eta obulutegi metastasikoko minbizia tratatzeko; izan ere, bi minbizi horiek kasuen pronostiko okerrenetakoak dituzte, eta normalean ondorengo etapetan diagnostikatzen dira. Tratamendu horien bidez, tumorearen hazkundea inhibitu egin da, obulutegi metastasikoko minbiziaren eta tumore-zelulen apoptosiaren biziraupena % 80an handitu da, tumorearen hazkundea % 50ean inhibitu da eta glioblastomaren biziraupena % 30ean hobetu da.[35]

2022ko abenduan, Great Ormond Street Ospitaleko medikuek 13 urteko neskato britainiar bat sendatu zuten, T zelulen leuzemia linfoblastiko akutua diagnostikatu ziotenean. Gene terapeutikoak editatzeko lehen erabilera dokumentatua izan zen, eta sei hilabetez tratamendu esperimental bat egin ondoren, porrot egin zuten beste tratamendu batzuen aurreko saiakerek. Prozedura izan zen T zelula osasuntsu bat birprogramatzea, minbizidun T zelulak suntsitzeko, lehenengo leuzemiatik libratzeko, eta, ondoren, bere sistema immunologikoa zerotik berreraikitzeko zelula immune osasuntsuak erabiliz.[36] Taldeak BASE edizioa erabili zuen, eta aurretik leuzemia linfoblastiko akutuko kasu bat tratatu zuen 2015ean, TALENak erabiliz.[37]

Diabetesa

1. motako diabetesa nahasmendu endokrinoa da, eta intsulina sortzeko beta zelula pankreatikorik ez izatearen ondorio da. Intsulina ezinbesteko konposatua da odolean dagoen azukrea zeluletara garraiatzean energia sortzeko. Beta zelula osasuntsuak transplantatzeko ahaleginetan aritu dira ikertzaileak. Zelulak editatzeko erabiltzen da CRISPR, pazientearen gorputzak transplantea errefusatzeko aukera murrizteko.

2021eko azaroaren 17an, CRISPR terapeutikak eta Cyte agentziak iragarri zuten Kanadako agentzia medikoak VCTX210-erako saiakuntza kliniko bat egiteko eskaera onartu zuela. Zelula amen terapia bat da VCTX210, CRISPR erakundeak editatua eta 1.motako diabetesa tratatzeko diseinatua. Esanguratsua izan zen hori, kliniketara heldu zen gene-edizioan oinarritutako diabetesarentzako lehen terapia izan zelako. Konpainia horiek 1. motako diabetesa tratatzeko tratamendu berri bat ere garatu zuten, intsulina ekoiztea lortu zuena CRIPSR teknikaren bitartez genetikoki editatutako zelula ametatik eratorritako milioika zelula pankreatiko erabiltzen dituen inplante mediko txiki baten bidez.[38]

2022ko otsailean, 1. faseko saiakuntza bat egin zen, eta paziente boluntario batek tratamendua jaso zuen.[39][40]

IHESa

Giza immunoeskasiaren birusa edo GIBa gorputzeko immunitate-sistemari erasotzen dion birusa da. Badira tratamendu eraginkorrak pazienteei bizitza osasuntsua izatea ahalbidetu diezaieketenak, baina GIBa atzeraeraginezkoa da, eta horrek esan nahi du bere buruaren bertsio ez-aktibo bat txertatzen duela giza genoman. CRISPR erabil daiteke birusa genomatik selektiboki ezabatzeko, GIBaren atzeraeraginezko genomari zuzendutako RNA gidaren diseinuaren bidez. Ikuspegi horrek duen arazoetako bat da GIBaren genoma ia zelula guztietatik kendu behar dela, eta hori lortzea zaila izan daiteke modu errealistan.[39]

GIBaren tratamenduan eta sendaketan hasierako emaitzak nahiko arrakastatsuak izan dira. 2021ean, antirretrobiralen eta CRISPR/Cas-9-aren konbinazioarekin tratatutako 23 sagu humanizatuetatik 9 sagutan birusa detektaezina bihurtzea lortu zuten, baita ohiko errebote-aldiaren ondoren ere. Bi tratamenduetako batek ere ez zuen ondorio hori izan isolaturik.[41] 2022an hasi ziren gizakietan CRISPR-Cas9 terapian oinarritutako EBT-101 entsegu klinikoak. 2023ko urrian, ETB-101-eko 3 pertsonatan egindako hasierako faseko ikerketa batek iragarri zuen tratamenduak segurua zirudiela eta ez zuela albo-ondorio garrantzitsurik, baina ez zen haren eraginkortasunari buruzko daturik eman.[42][43][44]

Erreferentziak

  1. ↑ a b (Ingelesez) Bak, Rasmus O.; Gomez-Ospina, Natalia; Porteus, Matthew H.. (2018-08). «Gene Editing on Center Stage» Trends in Genetics 34 (8): 600–611.  doi:10.1016/j.tig.2018.05.004. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  2. ↑ (Ingelesez) Zhang, Jian-Hua; Pandey, Mritunjay; Kahler, John F.; Loshakov, Anna; Harris, Benjamin; Dagur, Pradeep K.; Mo, Yin-Yuan; Simonds, William F.. (2014-11). «Improving the specificity and efficacy of CRISPR/CAS9 and gRNA through target specific DNA reporter» Journal of Biotechnology 189: 1–8.  doi:10.1016/j.jbiotec.2014.08.033. PMID 25193712. PMC PMC4252756. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  3. ↑ (Ingelesez) Vakulskas, Christopher A.; Dever, Daniel P.; Rettig, Garrett R.; Turk, Rolf; Jacobi, Ashley M.; Collingwood, Michael A.; Bode, Nicole M.; McNeill, Matthew S. et al.. (2018-08). «A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells» Nature Medicine 24 (8): 1216–1224.  doi:10.1038/s41591-018-0137-0. ISSN 1078-8956. PMID 30082871. PMC PMC6107069. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  4. ↑ (Ingelesez) «The Nobel Prize in Chemistry 2020» NobelPrize.org (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  5. ↑ (Ingelesez) CRISPR, the revolutionary genetic ‘scissors,' honored by Chemistry Nobel. 2021-03-08  doi:10.1126/science.abf0540. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  6. ↑ a b c d e f Mendoza-Téllez, Benjamín; Zamora-Bello, Alberto; Rosas-Paz, Miguel; Villarreal-Huerta, Diana; Fuente, Ileana de la; Segal-Kischinevzky, Claudia; González, James. (2022-10-17). «Introducción a los sistemas CRISPR y sus aplicaciones en levaduras» TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas 25 (0)  doi:10.22201/fesz.23958723e.2022.502. ISSN 2395-8723. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  7. ↑ a b c d (Ingelesez) Ran, F. Ann; Hsu, Patrick D.; Wright, Jason; Agarwala, Vineeta; Scott, David A.; Zhang, Feng. (2013-11). «Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system» Nature Protocols 8 (11): 2281–2308.  doi:10.1038/nprot.2013.143. ISSN 1750-2799. PMID 24157548. PMC PMC3969860. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  8. ↑ Joseph Ly. (2013). Ly Joseph P 201311 Ph D Thesis. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  9. ↑ (Ingelesez) Mohr, Stephanie E.; Hu, Yanhui; Ewen‐Campen, Benjamin; Housden, Benjamin E.; Viswanatha, Raghuvir; Perrimon, Norbert. (2016-09). «CRISPR guide RNA design for research applications» The FEBS Journal 283 (17): 3232–3238.  doi:10.1111/febs.13777. ISSN 1742-464X. PMID 27276584. PMC PMC5014588. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  10. ↑ (Ingelesez) Brazelton, Vincent A; Zarecor, Scott; Wright, David A; Wang, Yuan; Liu, Jie; Chen, Keting; Yang, Bing; Lawrence-Dill, Carolyn J. (2015-10-02). «A quick guide to CRISPR sgRNA design tools» GM Crops & Food 6 (4): 266–276.  doi:10.1080/21645698.2015.1137690. ISSN 2164-5698. PMID 26745836. PMC PMC5033207. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  11. ↑ (Ingelesez) Horvath, Philippe; Barrangou, Rodolphe. (2010-01-08). «CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea» Science 327 (5962): 167–170.  doi:10.1126/science.1179555. ISSN 0036-8075. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  12. ↑ (Ingelesez) Bialk, Pawel; Rivera-Torres, Natalia; Strouse, Bryan; Kmiec, Eric B.. (2015(e)ko eka. 8(a)). «Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems» PLOS ONE 10 (6): e0129308.  doi:10.1371/journal.pone.0129308. ISSN 1932-6203. PMID 26053390. PMC PMC4459703. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  13. ↑ (Ingelesez) Sander, Jeffry D.; Joung, J. Keith. (2014-04). «CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes» Nature Biotechnology 32 (4): 347–355.  doi:10.1038/nbt.2842. ISSN 1546-1696. PMID 24584096. PMC PMC4022601. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  14. ↑ (Ingelesez) Riesenberg, Stephan; Kanis, Philipp; Macak, Dominik; Wollny, Damian; Düsterhöft, Dorothee; Kowalewski, Johannes; Helmbrecht, Nelly; Maricic, Tomislav et al.. (2023-09). «Efficient high-precision homology-directed repair-dependent genome editing by HDRobust» Nature Methods 20 (9): 1388–1399.  doi:10.1038/s41592-023-01949-1. ISSN 1548-7105. PMID 37474806. PMC PMC10482697. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  15. ↑ (Ingelesez) Cai, Liquan; Fisher, Alfred L.; Huang, Haochu; Xie, Zijian. (2016-12). «CRISPR-mediated genome editing and human diseases» Genes & Diseases 3 (4): 244–251.  doi:10.1016/j.gendis.2016.07.003. PMID 30258895. PMC PMC6150104. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  16. ↑ (Ingelesez) Fernández, Clara Rodríguez. (2024-04-04). «Seven diseases CRISPR technology could cure» Labiotech.eu (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  17. ↑ a b (Ingelesez) «CRISPR/Cas9 and Cancer» Immuno-Oncology News (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  18. ↑ (Ingelesez) Crossley, Merlin. (2021-02-01). «New CRISPR technology could revolutionise gene therapy, offering new hope to people with genetic diseases» The Conversation (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  19. ↑ (Ingelesez) Cromer, M. Kyle; Camarena, Joab; Martin, Renata M.; Lesch, Benjamin J.; Vakulskas, Christopher A.; Bode, Nicole M.; Kurgan, Gavin; Collingwood, Michael A. et al.. (2021-04). «Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells» Nature Medicine 27 (4): 677–687.  doi:10.1038/s41591-021-01284-y. ISSN 1078-8956. PMID 33737751. PMC PMC8265212. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  20. ↑ (Ingelesez) Xie, Fei; Ye, Lin; Chang, Judy C.; Beyer, Ashley I.; Wang, Jiaming; Muench, Marcus O.; Kan, Yuet Wai. (2014-09). «Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac» Genome Research 24 (9): 1526–1533.  doi:10.1101/gr.173427.114. ISSN 1088-9051. PMID 25096406. PMC PMC4158758. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  21. ↑ a b (Ingelesez) Frangoul, Haydar; Altshuler, David; Cappellini, M. Domenica; Chen, Yi-Shan; Domm, Jennifer; Eustace, Brenda K.; Foell, Juergen; de la Fuente, Josu et al.. (2021-01-21). «CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia» New England Journal of Medicine 384 (3): 252–260.  doi:10.1056/NEJMoa2031054. ISSN 0028-4793. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  22. ↑ (Ingelesez) Dever, Daniel P.; Bak, Rasmus O.; Reinisch, Andreas; Camarena, Joab; Washington, Gabriel; Nicolas, Carmencita E.; Pavel-Dinu, Mara; Saxena, Nivi et al.. (2016-11-17). «CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells» Nature 539 (7629): 384–389.  doi:10.1038/nature20134. ISSN 0028-0836. PMID 27820943. PMC PMC5898607. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  23. ↑ (Ingelesez) Ktori, Sophia. (2018-05-02). «CRISPR “One Shot" Cell Therapy for Hemophilia Developed» GEN - Genetic Engineering and Biotechnology News (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  24. ↑ Marangi, Michele; Pistritto, Giuseppa. (2018-04-20). «Innovative Therapeutic Strategies for Cystic Fibrosis: Moving Forward to CRISPR Technique» Frontiers in Pharmacology 9  doi:10.3389/fphar.2018.00396. ISSN 1663-9812. PMID 29731717. PMC PMC5920621. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  25. ↑ (Ingelesez) Bengtsson, Niclas E.; Hall, John K.; Odom, Guy L.; Phelps, Michael P.; Andrus, Colin R.; Hawkins, R. David; Hauschka, Stephen D.; Chamberlain, Joel R. et al.. (2017-02-14). «Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy» Nature Communications 8 (1)  doi:10.1038/ncomms14454. ISSN 2041-1723. PMID 28195574. PMC PMC5316861. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  26. ↑ (Ingelesez) Eisenstein, Michael. (2018-05). «CRISPR takes on Huntington’s disease» Nature 557 (7707): S42–S43.  doi:10.1038/d41586-018-05177-y. ISSN 0028-0836. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  27. ↑ Dabrowska, Magdalena; Juzwa, Wojciech; Krzyzosiak, Wlodzimierz J.; Olejniczak, Marta. (2018-02-26). «Precise Excision of the CAG Tract from the Huntingtin Gene by Cas9 Nickases» Frontiers in Neuroscience 12  doi:10.3389/fnins.2018.00075. ISSN 1662-453X. PMID 29535594. PMC PMC5834764. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  28. ↑ (Ingelesez) King, Anthony. (2018-03-07). «A CRISPR edit for heart disease» Nature 555 (7695): S23–S25.  doi:10.1038/d41586-018-02482-4. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  29. ↑ (Ingelesez) Scudellari, Megan. (2019-07-09). «Self-destructing mosquitoes and sterilized rodents: the promise of gene drives» Nature 571 (7764): 160–162.  doi:10.1038/d41586-019-02087-5. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  30. ↑ (Ingelesez) Abrahimi, Parwiz; Chang, William G.; Kluger, Martin S.; Qyang, Yibing; Tellides, George; Saltzman, W. Mark; Pober, Jordan S.. (2015-07-03). «Efficient Gene Disruption in Cultured Primary Human Endothelial Cells by CRISPR/Cas9» Circulation Research 117 (2): 121–128.  doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.306290. ISSN 0009-7330. PMID 25940550. PMC PMC4490936. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  31. ↑ Stein, Rob. (2020). A Year In, 1st Patient To Get Gene Editing For Sickle Cell Disease Is Thriving. .
  32. ↑ (Ingelesez) «CRISPR technology to cure sickle cell disease» ScienceDaily (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  33. ↑ (Ingelesez) Uddin, Fathema; Rudin, Charles M.; Sen, Triparna. (2020-08-07). «CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future» Frontiers in Oncology 10  doi:10.3389/fonc.2020.01387. ISSN 2234-943X. PMID 32850447. PMC PMC7427626. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  34. ↑ (Ingelesez) Jensen, Trine I.; Axelgaard, Esben; Bak, Rasmus O.. (2019-06). «Therapeutic gene editing in haematological disorders with CRISPR /Cas9» British Journal of Haematology 185 (5): 821–835.  doi:10.1111/bjh.15851. ISSN 0007-1048. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  35. ↑ (Ingelesez) Rosenblum, Daniel; Gutkin, Anna; Kedmi, Ranit; Ramishetti, Srinivas; Veiga, Nuphar; Jacobi, Ashley M.; Schubert, Mollie S.; Friedmann-Morvinski, Dinorah et al.. (2020-11-20). «CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy» Science Advances 6 (47)  doi:10.1126/sciadv.abc9450. ISSN 2375-2548. PMID 33208369. PMC PMC7673804. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  36. ↑ (Ingelesez) Base editing: Revolutionary therapy clears girl's incurable cancer. 2022-12-11 (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  37. ↑ (Ingelesez) «'Designer cells' reverse one-year-old's cancer» BBC News 2015-11-05 (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  38. ↑ (Ingelesez) «B.C. researchers launching clinical trial for first genetically engineered stem cell-based therapy for type 1 diabetes» UBC News 2022-05-12 (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  39. ↑ a b (Ingelesez) «CRISPR Clinical Trials: A 2022 Update» Innovative Genomics Institute (IGI) (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  40. ↑ (Ingelesez) «CRISPR Therapeutics and ViaCyte, Inc. Announce First Patient Dosed in…» CRISPR Therapeutics (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  41. ↑ Dash, Prasanta K.; Kaminski, Rafal; Bella, Ramona; Su, Hang; Mathews, Saumi; Ahooyi, Taha M.; Chen, Chen; Mancuso, Pietro et al.. (2019-07-02). «Sequential LASER ART and CRISPR Treatments Eliminate HIV-1 in a Subset of Infected Humanized Mice» Nature Communications 10 (1): 2753.  doi:10.1038/s41467-019-10366-y. ISSN 2041-1723. PMID 31266936. PMC 6606613. (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  42. ↑ (Ingelesez) «First Clinical Trial of CRISPR-Based HIV Therapy Founded on Breakthrough Research at Lewis Katz School of Medicine» Lewis Katz School of Medicine (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  43. ↑ «ClinicalTrials.gov» clinicaltrials.gov (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).
  44. ↑ «Antiretroviral Therapy Combined With CRISPR Gene Editing Can Eliminate HIV Infection in Mice | NIDA Archives» archives.nida.nih.gov (Noiz kontsultatua: 2024-11-08).

Kanpo estekak