На момент введення в експлуатацію O 16 був найбільшим підводним човном у нідерландському Королівському флоті. З 11 січня по 16 квітня 1937 року човен здійснив перший ознайомчий похід. 5 лютого 1937 року O 16 прибув до порту Гамільтон, Бермудські Острови, 13–14 лютого він перебував з візитом у Норфолку та з 15 до 24 лютого в американській столиці, місті Вашингтон. Під час перебування у Вашингтоні командир ван Ванінг і один із гостей на борту підводного човна, Ф. А. Венінг Майнес, отримали аудієнцію в американського президента Франкліна Д. Рузвельта. Після Вашингтона O 16 продовжив свою подорож до Понта-Делгади (7–8 березня) та Лісабона (12 березня).
1 квітня O 16 вирушив додому в Нідерланди, щоб завершити свій похід, 16 квітня прибувши в голландський порт Ден-Гелдер.
У 1939 році O 16 був відправлений до Голландської Ост-Індії через Суецький канал і увійшов до складу тамтешньої дивізії підводних човнів. Це зробило його першим підводним човном серії O, який прибув у голландську Ост-Індію; зазвичай тільки підводні човни серії К відправлялися для проходження служби в колонію. Під час своєї подорожі до колонії підводний човен зупинявся у кількох портах, таких як Лісабон, Порт-Саїд і Аден. 5 червня 1939 року O 16 нарешті досяг пункту призначення, військово-морської бази Танджунг Пріок.
Незабаром після капітуляції Нідерландів у 1940 році ситуація в Південно-Східній Азії також різко загострілася. Очікувалася японська атака, а також ходили чутки про німецькі рейдери, які курсували поблизу Голландської Ост-Індії. З цією метою O 16 серед інших кораблів був відправлений на патрулювання навколо колоніальних вод, щоб перехопити ці рейдери. У вересні 1940 року O 16 і K XVIII були відправлені з Танджунг Пріока стежити за пароплавом Lematang і танкером Olivia під час їхньої подорожі з Дурбана до Лоренсо Маркеса з наміром потопити будь-який можливий німецький рейдер.
Окрім цих місій, O 16 здебільшого стояв у порту Сорабаджа, тоді як командування ВМС США, Королівських флотів Австралії та Великої Британії обговорювали з голландським керівництвом перспективи формування можливого союзу проти Японії (зокрема, вирішити, хто чим командує, які кораблі входитимуть до об'єднаного угруповання сил). Лише в листопаді голландський уряд у вигнанні, що перебував у Лондоні, вирішив, що I дивізіон підводних човнів, до якого належав O 16, перейде під британське командування.
Після переходу O 16 під британське командування, човен виходив у численні патрульні місії. Це почалося в листопаді 1941 року, коли його відправили на патрулювання в Південнокитайське море. Тому, його основним портом базування став Сінгапур. 6 грудня 1941 року O 16 був відправлений для патрулювання Сіамської затоки. Під час цього патрулювання O 16 помітив два японських міноносці, однак, оскільки війни з Японією на той час ще не було, торпеди не запускали.
Ця ситуація змінилася через день, 7 грудня, коли Японія напала на Перл-Гарбор. Це призвело до початку війни з японцями, й голландський уряд ухвалив рішення передати ще два дивізіони підводних човнів під британське командування, загалом три з чотирьох голландських дивізіонів підводних човнів. У ніч з 8 на 9 грудня O 16 помітив два японських міноносці, але їх не переслідував.
9 грудня, о 21:00, командир O 16 отримав повідомлення від британського командування про вихід до узбережжя Сіаму разом з іншими підводними човнами дивізіонів I і II (O 16, K XVIII, K XI, K XIII, K XII). Причиною цього було те, що поблизу узбережжя було помічено велику кількість транспортів японських військ. Наступного дня, 11 грудня о 6 годині ранку, підводним човнам було наказано взяти курс на східне узбережжя Малайського півострова, між Кота-Бару і Сінгора. Там були помічені японські військові кораблі й підводні човни мали їх потопити. Однак раніше тієї ночі O 16 помітив японський військовий корабель і запустив три торпеди, але через погану погоду екіпаж не зміг підтвердити, чи вони влучили в корабель і потопили його. 12 грудня O 16 знову помітив японський десантний корабель, який прямував до Патані. Антон Буссемакер, командир O 16, віддав наказ слідувати за кораблем.
Врешті-решт близько 21:30 військовий корабель пришвартувався в затоці Соенгей Патані, де було помічено більше японських військових кораблів. Глибина затоки була лише 11 метрів, тому O 16 довелося залишатися на поверхні, поки човен наближався до пришвартованих військових кораблів, використовуючи електродвигуни, щоб створювати якомога менше шуму. Чотири торпеди були запущені в чотири різні десантні кораблі. Після того, як чотири торпеди влучили в ціль і вибухнули, було запущено ще дві торпеди, в результаті чого три японських десантні кораблі частково затонули на мілководді затоки, а один був лише незначно пошкоджений.
15 грудня 1941 року при поверненні на базу в Сінгапурі O 16 натрапив на японську морську міну біля острова Тіоман. Лише одна людина з екіпажу з 42 осіб вижила. Той, хто вижив, зумів доплисти до острова Даянг і зрештою зв'язався з Королівським флотом Нідерландів, який доставив його до Сінгапуру.
Уламки O 16 не були знайдені до 1995 року, коли шведський дайвер на ім'я Стен Сьостранд натрапив на уламки.
Судна та кораблі, затоплені O 16
11 грудня 1941 — японський десантний корабель Аятосан-Мару (9 788 т) — пошкоджено
11 грудня 1941 — японський десантний корабель Сакура-Мару (7 170 т) — пошкоджено
12 грудня 1941 — японський десантний корабель Асосан-Мару (8 812 т) — потоплено
12 грудня 1941 — японський десантний корабель Тосан-Мару (8 666 т) — потоплено
12 грудня 1941 — японський десантний корабель Кінка-Мару (9 396 т) — потоплено
Вікісховище має мультимедійні дані за темою: HNLMS O 16
Jalhay, P.C.; Wijn, J.J.A. (1997). Ik nader ongezien! De onderzeeboten van de Koninklijke Marine. Amsterdam: De Bataafsche Leeuw. ISBN 9067074624.(нід.)
de Bles, Harry; Boven, Graddy; Homburg, Leon (2006). Onderzeeboten!. Zaltbommel/Den Helder: Aprilis/Marinemuseum. ISBN 978-9059941304.
van Royen, P.C. (1997). Hr.Ms. K XVII en Hr.Ms. O 16: De ondergang van twee Nederlandse onderzeeboten in de Zuid-Chinese Zee (1941). Amsterdam: Van Soeren. ISBN 978-90-6881-075-2.
.svg){kind=small}
.svg){kind=small}
.svg){kind=small}
.svg){kind=small}
.svg){kind=small}
.svg){kind=small}
.svg){kind=small}