PROFILPELAJAR.COM

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym^[a], PAGE (od ang. polyacrylamide gel electrophoresis) – technika używana w biologii molekularnej do rozdzielania makromolekuł, przede wszystkim białek i kwasów nukleinowych.

Żel poliakrylamidowy jest popularny w biologii molekularnej ze względu na dobre właściwości optyczne, obojętność elektryczną (brak grup naładowanych elektrycznie), możliwość uzyskania różnego stopnia porowatości^[1].

Żel powstaje w wyniku polimeryzacji akrylamidu i N,N′–metylenobisakrylamidu (bisakrylamidu), tworząc sieć elastycznych łańcuchów polimerowych, w którym migrują makromolekuły w polu elektrycznym. Polimeryzację tę katalizuje nadsiarczan amonu (APS) (lub nadsiarczan potasu) oraz N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiamina (TEMED) lub β-dimetyloaminopropionitryl (DMAP)^[1]^[2].

Proces zestalenia zajmuje w temperaturze pokojowej około 30 minut, jednak uzyskanie kompletnego usieciowania wymaga ok. 12 godzin. Jest to reakcja egzotermiczna, która może zakłócać sieciowanie, dlatego ten etap zwykle przeprowadza się w warunkach chłodniczych. Polimeryzację hamuje obecność tlenu, dlatego żel zabezpiecza się wodą lub butanolem. Wielkość porów można regulować proporcją akrylamidu do bisakrylamidu^[2]. Żele można przygotowywać jako płytowe lub też do stosowania w cienkich kolumnach w elektroforezie kapilarnej^[3].

Rozdział białek

Elektroforeza białek umożliwia ich uwidocznienie, zidentyfikowanie i scharakteryzowanie^[4]. Możliwe jest dzięki niej szybkie oszacowanie ilości białek w mieszaninie lub stopnia oczyszczenia określonego białka w próbce^[5].

Przygotowanie próbek

W próbkach do elektroforezy należy uzyskać odpowiednie stężenia białek – zbyt niskie spowoduje trudności w wykryciu, zbyt wysokie może spowodować nachodzenie na siebie prążków. Stężenie to nie powinno być większe niż 1–10 µg na prążek^[6].

Czasami konieczne jest usunięcie dużego stężenia soli z próbek ze względu na możliwe zakłócenia w analizie. Stosuje się w tym celu, między innymi, ultrafiltrację, precypitację, ekstrakcję do fazy stałej. Ponadto stosuje się detergenty do usuwania oddziaływań hydrofobowych sprzyjających agregacji i wytrącaniu białek^[6].

Warunki redukujące usuwają mostki dwusiarczkowe w białkach, co prowadzi do ich rozfałdowania. Ułatwiony jest w ten sposób kontakt enzymów. Najczęściej stosuje się β-merkaptoetanol (BME), ditiotreitol (DTE), tributylofosfinę (TBP), (tris(2-karboksyetyl)fosfina) (TCEP). W celu zabezpieczenia przed ponownym tworzeniem się mostków stosować można jodoacetamid^[6].

Przed umieszczeniem próbek w studzienkach zwykle dodaje się substancję obciążającą, przykładowo glicerynę, a także wprowadza barwnik (błękit bromofenolowy)^[6].

Elektroforeza w warunkach natywnych

Elektroforeza w warunkach natywnych (bez denaturacji) pozwala zachować natywną konformację białka, interakcje podjednostek oraz aktywność biologiczną. Białka rozdzielane są w tym wypadku na podstawie stosunku ładunku do masy^[7]. Bufor w dużej mierze decyduje o rozdzielczości rozdziału, a jego pH powinno być jak najbardziej zbliżone do punktu izoelektrycznego (pI) separowanych białek (inaczej może zajść denaturacja). Technika ma jednak wady w postaci stosunkowo małej rozdzielczości – trudno dobrać optymalne parametry równocześnie dla wszystkich białek^[8]. Dodatkowo obecność interakcji między białkami sprawia, że taki rozdział nie jest do końca przewidywalny^[9]

W rozdziale można polegać na ładunku własnym białka (ang. clear native PAGE), wtedy mogą migrować one w stronę jednej lub drugiej elektrody^[9]. Można jednak do białek dodać barwnik błękit Coomassie (ang. blue native PAGE), który tworzy z białkami kompleksy anionowe, przez przy rozdziale będą one przemieszczały się w stronę anody^[8].

Elektroforeza w warunkach denaturujących

Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) jest powszechnie stosowaną, szybką i łatwą techniką rozdziału białek charakteryzującą się dużą powtarzalnością. Po rozdziale można identyfikować białka za pomocą spektrometrii mas, western blottingu czy technik radiograficznych^[8].

Obecność SDS, anionowego detergentu, nadaje wszystkim cząsteczkom jednolity ładunek ujemny, powoduje denaturację białek, dzięki czemu ładunek przestaje wywierać wpływ na różnice w tempie migracji^[8]. Różnice w szybkości przemieszczania się białek zależą wtedy głównie od rozmiaru białka^[9].

W rozdziale SDS-PAGE najczęściej stosuje się system Laemmliego^[8]. Zakłada on występowanie żelu zagęszczającego (ang. stacking gel) o pH 6,8 i rozdzielającego (ang. resolving gel) o pH 8,8 i mniejszej porowatości. Żel zagęszczający ma skoncentrować białka w miejscu startu rozdziału, aby wszystkie zaczęły od tego samego punktu. W żelu rozdzielającym następuje rozdział według masy cząsteczkowej^[10].

Aby uwidocznić białka na żelu, najczęściej stosuje się błękit Coomassie lub sole srebra. Rzadziej wykonuje się barwienie fluorescencyjne (głównie barwnikami z grupy SYPRO) czy znakowanie izotopowe^[11].

Elektroforeza dwuwymiarowa

Elektroforeza dwuwymiarowa (dwukierunkowa) (2-DE) umożliwia rozdział białek zarówno ze względu na ich wielkość, jak i ładunek^[5]. Elektroforeza dwukierunkowa może służyć do rozdzielania skomplikowanych mieszanin białek^[12], dzięki niej można rozdzielić ponad 1000 białek do postaci dwuwymiarowej mapy^[13].

W pierwszym etapie białka rozdzielane są na podstawie ich punktu izoelektrycznego przy użyciu techniki ogniskowania izoelektrycznego. Wypadkowy ładunek białka zależny jest od ładunków aminokwasów wchodzących w jego skład. Ze względu na amfoteryczność białek ładunek końcowy zależy od pH roztworu, w którym się znajdują (w pH powyżej pI białko ma ujemny ładunek wypadkowy i wędruje w kierunku anody; w pH poniżej pI ma dodatni ładunek i migruje w stronę katody). Ładunek wypadkowy nie zależy od wielkości białek. Białko migruje w gradiencie pH do miejsca, w którym pH równe jest jego pI. W miejscu tym białko traci ładunek i staje się nieruchome (ogniskuje)^[5]. W drugim etapie białka poddaje się rozdziałowi metodą SDS-PAGE w kierunku prostopadłym do użytego w etapie pierwszym^[13].

Do zalet elektroforezy dwukierunkowej należy możliwość obserwacji np. modyfikacji potranslacyjnych, częściowej proteolizy, poziomu ekspresji białek. Do wad należy czasochłonność, brak pełnej automatyzacji, mała powtarzalność i nie zawsze zadowalająca rozdzielczość. Technika ta jest jednak stale ulepszana^[14].

Rozdział kwasów nukleinowych

W rozdziale kwasów nukleinowych najczęściej używanymi żelami w elektroforezie jest żel agarozowy i poliakrylamidowy^[15]. DNA naładowany jest ujemnie i migruje w stronę elektrody dodatniej^[16]. Elektroforezę przeprowadza się do czasu aż marker (zwykle błękit bromofenolowy) przemieści się na drugi koniec żelu^[15]. DNA zostaje rozdzielone według wielkości cząsteczek w związku z tym, że większe cząsteczki migrują wolniej od mniejszych. Wpływ ma też kształt i właściwości topologiczne)^[16]. Kwasy nukleinowe można potem zwizualizować przez dodatek bromku etydyny, który interkaluje między nukleotydami. Obraz w postaci pomarańczowych prążków można uzyskać w świetle UV^[15].

Żele poliakrylamidowe do rozdziału kwasów nukleinowych zawierają także mocznik o właściwościach denaturujących. Zapobiega to wewnętrznemu parowaniu zasad w kwasach, które mogłyby wytworzyć drugorzędowe struktury. Takie zmiany konformacji mogłyby wpłynąć na tempo migracji cząsteczek, uniezależniając je ściśle od długości (rozmiaru)^[3].

Elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do rozdziału kwasów nukleotydowych stosuje się, kiedy potrzebna jest duża rozdzielczość. Żele agarozowe mają większe pory i rozdział cząsteczek o wielkości poniżej 1500 pz staje się mniej dokładny^[3]. O ile 0,7% żel agarozowy jest w stanie rozdzielić cząsteczki kwasów nukleinowych o wielkości 300–20 000 pz, tak 10% żel poliakrylamidowy rozdziela cząsteczki o wielkości 25–500 pz, a 20% żel nawet 1–50 pz^[15].

Żele poliakrylamidowe stosuje się podczas sekwencjonowania DNA metodą terminacji łańcucha, gdy rozdzielane cząsteczki kwasów nukleinowych różnią się między sobą o pojedyncze nukleotydy^[3].

Uwagi

↑ także: elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

Przypisy

↑ ^a ^b Righetti P. G.: Polyacrylamide Gels. W: Reedijk J.: Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering. Elsevier, 2005, s. 396–407. DOI: 10.1016/B0-12-369397-7/00122-9. ISBN 978-0-12-409547-2.
↑ ^a ^b Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 50–51.
↑ ^a ^b ^c ^d T. A. Brown: Genomy. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2013, s. 104–105. ISBN 978-83-01-15634-3.
↑ Faoro V., Becker K. F., Stanta G.: One-Dimensional Sodium-Dodecyl-Sulfate (SDS) Polyacrylamide Gel Electrophoresis. W: Stanta G.: Guidelines for Molecular Analysis in Archive Tissues. Springer, 2011, s. 261–262. DOI: 10.1007/978-3-642-17890-0. ISBN 978-3-642-17889-4.
↑ ^a ^b ^c L. A. Allison: Podstawy Biologii Molekularnej. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2007, s. 252–253. ISBN 978-83-235-0527-3.
↑ ^a ^b ^c ^d Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 52–53.
↑ Protein Gel Electrophoresis Technical Handbook. ThermoFisher, 2015. [dostęp 2017-10-19]. (ang.).
↑ ^a ^b ^c ^d ^e Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 53–54.
↑ ^a ^b ^c A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bio-Rad. [dostęp 2017-10-18]. (ang.).
↑ Wu X., Koiwa H.. One-step casting of Laemmli discontinued sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis gel. „Biologia Plantarum”. 55 (1), s. 1–15, 2011. DOI: 10.1007/s10535-011-0001-2.
↑ Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 54–57.
↑ Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 61–62.
↑ ^a ^b Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Podstawy Biologii Komórki cz. 1. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2016, s. 162–163. ISBN 978-83-01-14468-5.
↑ Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 67.
↑ ^a ^b ^c ^d D. S. T. Nicholl: An Introduction to Genetic Engineering. Warszawa: Cambridge University Press, 2008, s. 40–41. ISBN 978-0-521-85006-3.
↑ ^a ^b Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R.: Molecular Biology of the Gene. Pearson Education, 2004, s. 648–649. ISBN 0-321-22368-3.

Bibliografia

A. Kraj, A. Drabik, J. Silberring: Proteomika i Metabolika. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2010. ISBN 978-83-235-0765-9.

[1] także: elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

[Righetti-2] Righetti P. G.: Polyacrylamide Gels. W: Reedijk J.: Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering. Elsevier, 2005, s. 396–407. DOI: 10.1016/B0-12-369397-7/00122-9. ISBN 978-0-12-409547-2.

[CITEREFKrajDrabikSilberring201050–51-3] Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 50–51.

[Brown-4] T. A. Brown: Genomy. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2013, s. 104–105. ISBN 978-83-01-15634-3.

[Faoro-5] Faoro V., Becker K. F., Stanta G.: One-Dimensional Sodium-Dodecyl-Sulfate (SDS) Polyacrylamide Gel Electrophoresis. W: Stanta G.: Guidelines for Molecular Analysis in Archive Tissues. Springer, 2011, s. 261–262. DOI: 10.1007/978-3-642-17890-0. ISBN 978-3-642-17889-4.

[Allison-6] L. A. Allison: Podstawy Biologii Molekularnej. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2007, s. 252–253. ISBN 978-83-235-0527-3.

[CITEREFKrajDrabikSilberring201052–53-7] Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 52–53.

[ThermoFisher-8] Protein Gel Electrophoresis Technical Handbook. ThermoFisher, 2015. [dostęp 2017-10-19]. (ang.).

[CITEREFKrajDrabikSilberring201053–54-9] Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 53–54.

[BioRad-10] A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bio-Rad. [dostęp 2017-10-18]. (ang.).

[Wu-11] Wu X., Koiwa H.. One-step casting of Laemmli discontinued sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis gel. „Biologia Plantarum”. 55 (1), s. 1–15, 2011. DOI: 10.1007/s10535-011-0001-2.

[CITEREFKrajDrabikSilberring201054–57-12] Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 54–57.

[CITEREFKrajDrabikSilberring201061–62-13] Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 61–62.

[Alberts1-14] Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Podstawy Biologii Komórki cz. 1. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2016, s. 162–163. ISBN 978-83-01-14468-5.

[CITEREFKrajDrabikSilberring201067-15] Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 67.

[Nicholl-16] D. S. T. Nicholl: An Introduction to Genetic Engineering. Warszawa: Cambridge University Press, 2008, s. 40–41. ISBN 978-0-521-85006-3.

[Watson-17] Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R.: Molecular Biology of the Gene. Pearson Education, 2004, s. 648–649. ISBN 0-321-22368-3.

[a]

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

PROFILPELAJAR.COM

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

Rozdział białek

Przygotowanie próbek

Elektroforeza w warunkach natywnych

Elektroforeza w warunkach denaturujących

Elektroforeza dwuwymiarowa

Rozdział kwasów nukleinowych

Uwagi

Przypisy

Bibliografia

Read other articles:

Victoria Blair Rhemrev

Edgar Morin

Mosche da bar

Fritz Odemar

Daftar rumah sakit di Kalimantan Utara

Nukleolus

Bandar Udara Cut Nyak Dhien Nagan Raya

Jonathan Ernest

Jean Walschaerts

Pembicaraan Pengguna:Medelam

Азиатский барсук

ويست أثينا (كاليفورنيا)

كهف مونكس

A19 autoroute

Australian Intelligence Community

Greenhouse gas emissions by China

Červená Lhota

Ancient furniture

Filippo IV di Francia

Template talk:NS locos