Żel poliakrylamidowy jest popularny w biologii molekularnej ze względu na dobre właściwości optyczne, obojętność elektryczną (brak grup naładowanych elektrycznie), możliwość uzyskania różnego stopnia porowatości[1].
Proces zestalenia zajmuje w temperaturze pokojowej około 30 minut, jednak uzyskanie kompletnego usieciowania wymaga ok. 12 godzin. Jest to reakcja egzotermiczna, która może zakłócać sieciowanie, dlatego ten etap zwykle przeprowadza się w warunkach chłodniczych. Polimeryzację hamuje obecność tlenu, dlatego żel zabezpiecza się wodą lub butanolem. Wielkość porów można regulować proporcją akrylamidu do bisakrylamidu[2]. Żele można przygotowywać jako płytowe lub też do stosowania w cienkich kolumnach w elektroforezie kapilarnej[3].
Rozdział białek
Elektroforeza białek umożliwia ich uwidocznienie, zidentyfikowanie i scharakteryzowanie[4]. Możliwe jest dzięki niej szybkie oszacowanie ilości białek w mieszaninie lub stopnia oczyszczenia określonego białka w próbce[5].
Przygotowanie próbek
W próbkach do elektroforezy należy uzyskać odpowiednie stężenia białek – zbyt niskie spowoduje trudności w wykryciu, zbyt wysokie może spowodować nachodzenie na siebie prążków. Stężenie to nie powinno być większe niż 1–10 µg na prążek[6].
Przed umieszczeniem próbek w studzienkach zwykle dodaje się substancję obciążającą, przykładowo glicerynę, a także wprowadza barwnik (błękit bromofenolowy)[6].
Elektroforeza w warunkach natywnych
Elektroforeza w warunkach natywnych (bez denaturacji) pozwala zachować natywną konformację białka, interakcje podjednostek oraz aktywność biologiczną. Białka rozdzielane są w tym wypadku na podstawie stosunku ładunku do masy[7]. Bufor w dużej mierze decyduje o rozdzielczości rozdziału, a jego pH powinno być jak najbardziej zbliżone do punktu izoelektrycznego (pI) separowanych białek (inaczej może zajść denaturacja). Technika ma jednak wady w postaci stosunkowo małej rozdzielczości – trudno dobrać optymalne parametry równocześnie dla wszystkich białek[8]. Dodatkowo obecność interakcji między białkami sprawia, że taki rozdział nie jest do końca przewidywalny[9]
W rozdziale można polegać na ładunku własnym białka (ang. clear native PAGE), wtedy mogą migrować one w stronę jednej lub drugiej elektrody[9]. Można jednak do białek dodać barwnik błękit Coomassie (ang. blue native PAGE), który tworzy z białkami kompleksy anionowe, przez przy rozdziale będą one przemieszczały się w stronę anody[8].
Elektroforeza w warunkach denaturujących
Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) jest powszechnie stosowaną, szybką i łatwą techniką rozdziału białek charakteryzującą się dużą powtarzalnością. Po rozdziale można identyfikować białka za pomocą spektrometrii mas, western blottingu czy technik radiograficznych[8].
Obecność SDS, anionowego detergentu, nadaje wszystkim cząsteczkom jednolity ładunek ujemny, powoduje denaturację białek, dzięki czemu ładunek przestaje wywierać wpływ na różnice w tempie migracji[8]. Różnice w szybkości przemieszczania się białek zależą wtedy głównie od rozmiaru białka[9].
W rozdziale SDS-PAGE najczęściej stosuje się system Laemmliego[8]. Zakłada on występowanie żelu zagęszczającego (ang. stacking gel) o pH 6,8 i rozdzielającego (ang. resolving gel) o pH 8,8 i mniejszej porowatości. Żel zagęszczający ma skoncentrować białka w miejscu startu rozdziału, aby wszystkie zaczęły od tego samego punktu. W żelu rozdzielającym następuje rozdział według masy cząsteczkowej[10].
Aby uwidocznić białka na żelu, najczęściej stosuje się błękit Coomassie lub sole srebra. Rzadziej wykonuje się barwienie fluorescencyjne (głównie barwnikami z grupy SYPRO) czy znakowanie izotopowe[11].
Elektroforeza dwuwymiarowa
Elektroforeza dwuwymiarowa (dwukierunkowa) (2-DE) umożliwia rozdział białek zarówno ze względu na ich wielkość, jak i ładunek[5]. Elektroforeza dwukierunkowa może służyć do rozdzielania skomplikowanych mieszanin białek[12], dzięki niej można rozdzielić ponad 1000 białek do postaci dwuwymiarowej mapy[13].
W pierwszym etapie białka rozdzielane są na podstawie ich punktu izoelektrycznego przy użyciu techniki ogniskowania izoelektrycznego. Wypadkowy ładunek białka zależny jest od ładunków aminokwasów wchodzących w jego skład. Ze względu na amfoteryczność białek ładunek końcowy zależy od pH roztworu, w którym się znajdują (w pH powyżej pI białko ma ujemny ładunek wypadkowy i wędruje w kierunku anody; w pH poniżej pI ma dodatni ładunek i migruje w stronę katody). Ładunek wypadkowy nie zależy od wielkości białek. Białko migruje w gradiencie pH do miejsca, w którym pH równe jest jego pI. W miejscu tym białko traci ładunek i staje się nieruchome (ogniskuje)[5]. W drugim etapie białka poddaje się rozdziałowi metodą SDS-PAGE w kierunku prostopadłym do użytego w etapie pierwszym[13].
Do zalet elektroforezy dwukierunkowej należy możliwość obserwacji np. modyfikacji potranslacyjnych, częściowej proteolizy, poziomu ekspresji białek. Do wad należy czasochłonność, brak pełnej automatyzacji, mała powtarzalność i nie zawsze zadowalająca rozdzielczość. Technika ta jest jednak stale ulepszana[14].
Rozdział kwasów nukleinowych
W rozdziale kwasów nukleinowych najczęściej używanymi żelami w elektroforezie jest żel agarozowy i poliakrylamidowy[15]. DNA naładowany jest ujemnie i migruje w stronę elektrody dodatniej[16]. Elektroforezę przeprowadza się do czasu aż marker (zwykle błękit bromofenolowy) przemieści się na drugi koniec żelu[15]. DNA zostaje rozdzielone według wielkości cząsteczek w związku z tym, że większe cząsteczki migrują wolniej od mniejszych. Wpływ ma też kształt i właściwości topologiczne)[16]. Kwasy nukleinowe można potem zwizualizować przez dodatek bromku etydyny, który interkaluje między nukleotydami. Obraz w postaci pomarańczowych prążków można uzyskać w świetle UV[15].
Żele poliakrylamidowe do rozdziału kwasów nukleinowych zawierają także mocznik o właściwościach denaturujących. Zapobiega to wewnętrznemu parowaniu zasad w kwasach, które mogłyby wytworzyć drugorzędowe struktury. Takie zmiany konformacji mogłyby wpłynąć na tempo migracji cząsteczek, uniezależniając je ściśle od długości (rozmiaru)[3].
Elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do rozdziału kwasów nukleotydowych stosuje się, kiedy potrzebna jest duża rozdzielczość. Żele agarozowe mają większe pory i rozdział cząsteczek o wielkości poniżej 1500 pz staje się mniej dokładny[3]. O ile 0,7% żel agarozowy jest w stanie rozdzielić cząsteczki kwasów nukleinowych o wielkości 300–20 000 pz, tak 10% żel poliakrylamidowy rozdziela cząsteczki o wielkości 25–500 pz, a 20% żel nawet 1–50 pz[15].
Żele poliakrylamidowe stosuje się podczas sekwencjonowania DNA metodą terminacji łańcucha, gdy rozdzielane cząsteczki kwasów nukleinowych różnią się między sobą o pojedyncze nukleotydy[3].
↑ abAlberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Podstawy Biologii Komórki cz. 1. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2016, s. 162–163. ISBN 978-83-01-14468-5.
↑ abWatson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R.: Molecular Biology of the Gene. Pearson Education, 2004, s. 648–649. ISBN 0-321-22368-3.
Bibliografia
A. Kraj, A. Drabik, J. Silberring: Proteomika i Metabolika. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2010. ISBN 978-83-235-0765-9.