Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

Aparat do elektroforezy

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym[a], PAGE (od ang. polyacrylamide gel electrophoresis) – technika używana w biologii molekularnej do rozdzielania makromolekuł, przede wszystkim białek i kwasów nukleinowych.

Żel poliakrylamidowy jest popularny w biologii molekularnej ze względu na dobre właściwości optyczne, obojętność elektryczną (brak grup naładowanych elektrycznie), możliwość uzyskania różnego stopnia porowatości[1].

Żel powstaje w wyniku polimeryzacji akrylamidu i N,N′–metylenobisakrylamidu (bisakrylamidu), tworząc sieć elastycznych łańcuchów polimerowych, w którym migrują makromolekuły w polu elektrycznym. Polimeryzację tę katalizuje nadsiarczan amonu (APS) (lub nadsiarczan potasu) oraz N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiamina (TEMED) lub β-dimetyloaminopropionitryl (DMAP)[1][2].

Proces zestalenia zajmuje w temperaturze pokojowej około 30 minut, jednak uzyskanie kompletnego usieciowania wymaga ok. 12 godzin. Jest to reakcja egzotermiczna, która może zakłócać sieciowanie, dlatego ten etap zwykle przeprowadza się w warunkach chłodniczych. Polimeryzację hamuje obecność tlenu, dlatego żel zabezpiecza się wodą lub butanolem. Wielkość porów można regulować proporcją akrylamidu do bisakrylamidu[2]. Żele można przygotowywać jako płytowe lub też do stosowania w cienkich kolumnach w elektroforezie kapilarnej[3].

Rozdział białek

Żele po elektroforezie SDS-PAGE

Elektroforeza białek umożliwia ich uwidocznienie, zidentyfikowanie i scharakteryzowanie[4]. Możliwe jest dzięki niej szybkie oszacowanie ilości białek w mieszaninie lub stopnia oczyszczenia określonego białka w próbce[5].

Przygotowanie próbek

Umieszczanie próbek w studzienkach

W próbkach do elektroforezy należy uzyskać odpowiednie stężenia białek – zbyt niskie spowoduje trudności w wykryciu, zbyt wysokie może spowodować nachodzenie na siebie prążków. Stężenie to nie powinno być większe niż 1–10 µg na prążek[6].

Czasami konieczne jest usunięcie dużego stężenia soli z próbek ze względu na możliwe zakłócenia w analizie. Stosuje się w tym celu, między innymi, ultrafiltrację, precypitację, ekstrakcję do fazy stałej. Ponadto stosuje się detergenty do usuwania oddziaływań hydrofobowych sprzyjających agregacji i wytrącaniu białek[6].

Warunki redukujące usuwają mostki dwusiarczkowe w białkach, co prowadzi do ich rozfałdowania. Ułatwiony jest w ten sposób kontakt enzymów. Najczęściej stosuje się β-merkaptoetanol (BME), ditiotreitol (DTE), tributylofosfinę (TBP), (tris(2-karboksyetyl)fosfina) (TCEP). W celu zabezpieczenia przed ponownym tworzeniem się mostków stosować można jodoacetamid[6].

Przed umieszczeniem próbek w studzienkach zwykle dodaje się substancję obciążającą, przykładowo glicerynę, a także wprowadza barwnik (błękit bromofenolowy)[6].

Elektroforeza w warunkach natywnych

Elektroforeza w warunkach natywnych (bez denaturacji) pozwala zachować natywną konformację białka, interakcje podjednostek oraz aktywność biologiczną. Białka rozdzielane są w tym wypadku na podstawie stosunku ładunku do masy[7]. Bufor w dużej mierze decyduje o rozdzielczości rozdziału, a jego pH powinno być jak najbardziej zbliżone do punktu izoelektrycznego (pI) separowanych białek (inaczej może zajść denaturacja). Technika ma jednak wady w postaci stosunkowo małej rozdzielczości – trudno dobrać optymalne parametry równocześnie dla wszystkich białek[8]. Dodatkowo obecność interakcji między białkami sprawia, że taki rozdział nie jest do końca przewidywalny[9]

W rozdziale można polegać na ładunku własnym białka (ang. clear native PAGE), wtedy mogą migrować one w stronę jednej lub drugiej elektrody[9]. Można jednak do białek dodać barwnik błękit Coomassie (ang. blue native PAGE), który tworzy z białkami kompleksy anionowe, przez przy rozdziale będą one przemieszczały się w stronę anody[8].

Elektroforeza w warunkach denaturujących

Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) jest powszechnie stosowaną, szybką i łatwą techniką rozdziału białek charakteryzującą się dużą powtarzalnością. Po rozdziale można identyfikować białka za pomocą spektrometrii mas, western blottingu czy technik radiograficznych[8].

Obecność SDS, anionowego detergentu, nadaje wszystkim cząsteczkom jednolity ładunek ujemny, powoduje denaturację białek, dzięki czemu ładunek przestaje wywierać wpływ na różnice w tempie migracji[8]. Różnice w szybkości przemieszczania się białek zależą wtedy głównie od rozmiaru białka[9].

W rozdziale SDS-PAGE najczęściej stosuje się system Laemmliego[8]. Zakłada on występowanie żelu zagęszczającego (ang. stacking gel) o pH 6,8 i rozdzielającego (ang. resolving gel) o pH 8,8 i mniejszej porowatości. Żel zagęszczający ma skoncentrować białka w miejscu startu rozdziału, aby wszystkie zaczęły od tego samego punktu. W żelu rozdzielającym następuje rozdział według masy cząsteczkowej[10].

Aby uwidocznić białka na żelu, najczęściej stosuje się błękit Coomassie lub sole srebra. Rzadziej wykonuje się barwienie fluorescencyjne (głównie barwnikami z grupy SYPRO) czy znakowanie izotopowe[11].

Elektroforeza dwuwymiarowa

Żel z rozdzielonymi białkami po elektroforezie dwuwymiarowej. Na osi X rozdział względem pI, na osi Y względem masy cząsteczkowej

Elektroforeza dwuwymiarowa (dwukierunkowa) (2-DE) umożliwia rozdział białek zarówno ze względu na ich wielkość, jak i ładunek[5]. Elektroforeza dwukierunkowa może służyć do rozdzielania skomplikowanych mieszanin białek[12], dzięki niej można rozdzielić ponad 1000 białek do postaci dwuwymiarowej mapy[13].

W pierwszym etapie białka rozdzielane są na podstawie ich punktu izoelektrycznego przy użyciu techniki ogniskowania izoelektrycznego. Wypadkowy ładunek białka zależny jest od ładunków aminokwasów wchodzących w jego skład. Ze względu na amfoteryczność białek ładunek końcowy zależy od pH roztworu, w którym się znajdują (w pH powyżej pI białko ma ujemny ładunek wypadkowy i wędruje w kierunku anody; w pH poniżej pI ma dodatni ładunek i migruje w stronę katody). Ładunek wypadkowy nie zależy od wielkości białek. Białko migruje w gradiencie pH do miejsca, w którym pH równe jest jego pI. W miejscu tym białko traci ładunek i staje się nieruchome (ogniskuje)[5]. W drugim etapie białka poddaje się rozdziałowi metodą SDS-PAGE w kierunku prostopadłym do użytego w etapie pierwszym[13].

Do zalet elektroforezy dwukierunkowej należy możliwość obserwacji np. modyfikacji potranslacyjnych, częściowej proteolizy, poziomu ekspresji białek. Do wad należy czasochłonność, brak pełnej automatyzacji, mała powtarzalność i nie zawsze zadowalająca rozdzielczość. Technika ta jest jednak stale ulepszana[14].

Rozdział kwasów nukleinowych

W rozdziale kwasów nukleinowych najczęściej używanymi żelami w elektroforezie jest żel agarozowy i poliakrylamidowy[15]. DNA naładowany jest ujemnie i migruje w stronę elektrody dodatniej[16]. Elektroforezę przeprowadza się do czasu aż marker (zwykle błękit bromofenolowy) przemieści się na drugi koniec żelu[15]. DNA zostaje rozdzielone według wielkości cząsteczek w związku z tym, że większe cząsteczki migrują wolniej od mniejszych. Wpływ ma też kształt i właściwości topologiczne)[16]. Kwasy nukleinowe można potem zwizualizować przez dodatek bromku etydyny, który interkaluje między nukleotydami. Obraz w postaci pomarańczowych prążków można uzyskać w świetle UV[15].

Żele poliakrylamidowe do rozdziału kwasów nukleinowych zawierają także mocznik o właściwościach denaturujących. Zapobiega to wewnętrznemu parowaniu zasad w kwasach, które mogłyby wytworzyć drugorzędowe struktury. Takie zmiany konformacji mogłyby wpłynąć na tempo migracji cząsteczek, uniezależniając je ściśle od długości (rozmiaru)[3].

Elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do rozdziału kwasów nukleotydowych stosuje się, kiedy potrzebna jest duża rozdzielczość. Żele agarozowe mają większe pory i rozdział cząsteczek o wielkości poniżej 1500 pz staje się mniej dokładny[3]. O ile 0,7% żel agarozowy jest w stanie rozdzielić cząsteczki kwasów nukleinowych o wielkości 300–20 000 pz, tak 10% żel poliakrylamidowy rozdziela cząsteczki o wielkości 25–500 pz, a 20% żel nawet 1–50 pz[15].

Żele poliakrylamidowe stosuje się podczas sekwencjonowania DNA metodą terminacji łańcucha, gdy rozdzielane cząsteczki kwasów nukleinowych różnią się między sobą o pojedyncze nukleotydy[3].

Uwagi

  1. także: elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

Przypisy

  1. a b Righetti P. G.: Polyacrylamide Gels. W: Reedijk J.: Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering. Elsevier, 2005, s. 396–407. DOI: 10.1016/B0-12-369397-7/00122-9. ISBN 978-0-12-409547-2.
  2. a b Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 50–51.
  3. a b c d T. A. Brown: Genomy. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2013, s. 104–105. ISBN 978-83-01-15634-3.
  4. Faoro V., Becker K. F., Stanta G.: One-Dimensional Sodium-Dodecyl-Sulfate (SDS) Polyacrylamide Gel Electrophoresis. W: Stanta G.: Guidelines for Molecular Analysis in Archive Tissues. Springer, 2011, s. 261–262. DOI: 10.1007/978-3-642-17890-0. ISBN 978-3-642-17889-4.
  5. a b c L. A. Allison: Podstawy Biologii Molekularnej. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2007, s. 252–253. ISBN 978-83-235-0527-3.
  6. a b c d Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 52–53.
  7. Protein Gel Electrophoresis Technical Handbook. ThermoFisher, 2015. [dostęp 2017-10-19]. (ang.).
  8. a b c d e Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 53–54.
  9. a b c A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bio-Rad. [dostęp 2017-10-18]. (ang.).
  10. Wu X., Koiwa H.. One-step casting of Laemmli discontinued sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis gel. „Biologia Plantarum”. 55 (1), s. 1–15, 2011. DOI: 10.1007/s10535-011-0001-2. 
  11. Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 54–57.
  12. Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 61–62.
  13. a b Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P.: Podstawy Biologii Komórki cz. 1. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2016, s. 162–163. ISBN 978-83-01-14468-5.
  14. Kraj, Drabik i Silberring 2010 ↓, s. 67.
  15. a b c d D. S. T. Nicholl: An Introduction to Genetic Engineering. Warszawa: Cambridge University Press, 2008, s. 40–41. ISBN 978-0-521-85006-3.
  16. a b Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R.: Molecular Biology of the Gene. Pearson Education, 2004, s. 648–649. ISBN 0-321-22368-3.

Bibliografia

  • A. Kraj, A. Drabik, J. Silberring: Proteomika i Metabolika. Warszawa: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2010. ISBN 978-83-235-0765-9.

Read other articles:

Artikel ini sebatang kara, artinya tidak ada artikel lain yang memiliki pranala balik ke halaman ini.Bantulah menambah pranala ke artikel ini dari artikel yang berhubungan atau coba peralatan pencari pranala.Tag ini diberikan pada Desember 2023. Victoria Blair RhemrevLahir2 Januari 2003 (umur 21)Hartford, Connecticut, Amerika SerikatPendidikanStevenson High SchoolDuke University(jurusan Marine Biology program)Kota asalLong Grove, Illinois, Amerika SerikatTinggi5 ft 9 in (1...

 

 

Edgar Morin (2011). Edgar Morin adalah seorang filsuf dan sosiolog dari Prancis.[1] Dia dikenal karena keahliannya dalam bidang ilmu transdisiplin. Biografi Pada awal abad ke 20, keluarganya pindah dari Yunani ke Marseille[2] lalu ke Prancis di mana Edgar dilahirkan pada tanggal 8 Juli 1921 dengan nama Edgar Nahoum. Perkenalannya pertama kali pada sosialisme terjadi saat Perang Saudara di Spanyol. Ketika Jerman menginvansi Prancis pada tahun 1940, Edgar mengungsi ke Toulouse d...

 

 

Mosche da barUna scena del filmTitolo originaleTrees Lounge Paese di produzioneStati Uniti d'America Anno1996 Durata105 min Generecommedia, drammatico RegiaSteve Buscemi SoggettoSteve Buscemi SceneggiaturaSteve Buscemi ProduttoreChris Hanley, Brad Wyman, Kelly Forsythe, Sarah Vogel, Christina Larsson Produttore esecutivoNick Wechsler, Julie Yorn Distribuzione in italianoAcademy Pictures FotografiaLisa Rinzler MontaggioKate Williams MusicheEvan Lurie Interpreti e personaggi Steve Buscemi: ...

Fritz OdemarLahir(1890-01-13)13 Januari 1890Hannover, JermanMeninggal6 Juni 1955(1955-06-06) (umur 65)Munich, JermanPekerjaanPemeranTahun aktif1927–1955 Fritz Odemar (13 Januari 1890 – 6 Juni 1955) adalah seorang pemeran film asal Jerman.[1] Ia tampil dalam 152 film antara 1927 dan 1955. Ia lahir di Hannover, Jerman dan wafat di Munich, Jerman. Ayah Odemar adalah pemeran Fritz Odemar Sr. (Karl Julius Friedrich Odemar; 1858–1926). Referensi ^ Fritz Odemar...

 

 

Berikut ini adalah daftar rumah sakit di Kalimantan Utara yang dibagi berdasarkan wilayah, yakni kabupaten dan kota.[1] No. Kode RS Nama Rumah Sakit Jenis RS Kelas RS Pemilik Total Ranjang 1 6501013 RS Pratama Long Ampung RSU D PRATAMA Pemkab 19 2 6503002 RS Umum Daerah Akhmad Berahim RSU D PRATAMA Pemkab 13 3 6571044 RS Umum Kota Tarakan RSU C Pemkot 73 4 6473043 RS Umum Pertamedika Tarakan RSU D Perusahaan 36 5 6406012 RS Umum Daerah Kabupaten Malinau RSU C Pemkab 163 6 6473042 RS A...

 

 

Biologi selSel hewanKomponen sel hewan pada umumnya: Nukleolus Inti sel Ribosom (titik-titik kecil sebagai bagian dari no. 5) Vesikel Retikulum endoplasma kasar Badan Golgi Sitoskeleton Retikulum endoplasma halus Mitokondria Vakuola Sitosol (cairan yang berisi organel, yang terdiri dari sitoplasma) Lisosom Sentrosom Membran sel Nukleolus terkandung dalam inti sel. Nukleolus (jamak nukleoli, Latin: nucleoluscode: la is deprecated , dikenal juga sebagai anak inti sel) adalah sebuah struktur ter...

Bandar Udara Cut Nyak DhienCut Nyak Dhien AirportIATA: MEQICAO: WITCInformasiJenisPublikPemilikKementerian PerhubunganPengelolaDirektorat Jenderal Perhubungan UdaraLokasiKabupaten Nagan RayaKetinggian dpl mdplKoordinat04°02′37.38″N 96°15′03.01″E / 4.0437167°N 96.2508361°E / 4.0437167; 96.2508361Situs webmeq.informasibandara.orgPetaMEQLokasi di Aceh, Sumatera Utara, Sumatra dan IndonesiaTampilkan peta AcehMEQMEQ (Sumatra Utara)Tampilkan peta Sumatr...

 

 

Artikel ini sebatang kara, artinya tidak ada artikel lain yang memiliki pranala balik ke halaman ini.Bantulah menambah pranala ke artikel ini dari artikel yang berhubungan atau coba peralatan pencari pranala.Tag ini diberikan pada Februari 2023. Jonathan ErnestInformasi pribadiPosisi bermain PenyerangInformasi klubKlub saat ini AS Port-Louis 2000Karier senior*Tahun Tim Tampil (Gol)2006–2007 Faucon Flacq SC 2007– AS Port-Louis 2000 Tim nasional‡2009–2010 Mauritius 3 (0) * Penampilan da...

 

 

Jean WalschaertsJean Walschaerts en 1963InformationsNaissance 19 mai 1943 (80 ans)BerchemNationalité belgeÉquipes professionnelles 1966Pelforth-Sauvage-Lejeune1967individuelPrincipales victoires Champion du monde de poursuite amateurs (1963)modifier - modifier le code - modifier Wikidata Jean Walschaerts (né le 19 mai 1943 à Anvers) est un coureur cycliste belge. Il a notamment été champion du monde de poursuite amateur en 1963. Il a ensuite été professionnel en 1966 et 1967[1]. ...

Halaman ini diarsipkan secara otomatis oleh HsfBot (lihat instruksi) Pengguna ini sedang sibuk di dunia nyata dan mungkin tidak menanggapi pesan dengan cepat. Pengguna ini terakhir daring sejak 6 hari 343 menit lalu.Tinggalkan pesan Taman Doa Our Lady of Akita, Pantai Indah Kapuk Dua Selamat malam Bung. Saya ingin bertanya sebenarnya stasi tersebut berada di paroki mana ya? Di artikel menyebutkan stasi tersebut berada dalam Paroki PIK, sedangkan yang saya lihat di peta teritorial Paroki Tang...

 

 

Азиатский барсук Научная классификация Домен:ЭукариотыЦарство:ЖивотныеПодцарство:ЭуметазоиБез ранга:Двусторонне-симметричныеБез ранга:ВторичноротыеТип:ХордовыеПодтип:ПозвоночныеИнфратип:ЧелюстноротыеНадкласс:ЧетвероногиеКлада:АмниотыКлада:СинапсидыКласс:Мле�...

 

 

ويست أثينا   الإحداثيات 33°55′21″N 118°18′04″W / 33.9225°N 118.301°W / 33.9225; -118.301   تقسيم إداري  البلد الولايات المتحدة[1]  التقسيم الأعلى مقاطعة لوس أنجلوس  خصائص جغرافية  المساحة 3.461385 كيلومتر مربع3.461384 كيلومتر مربع (1 أبريل 2010)  ارتفاع 58 متر  عدد السكا�...

كهف مونكسمعلومات عامةالمكان Christchurch City (en) البلد  نيوزيلندا الإحداثيات 43°34′S 172°44′E / 43.56°S 172.74°E / -43.56; 172.74 الاكتشاف 1889 تعديل - تعديل مصدري - تعديل ويكي بيانات كهف مونكس هو كهف يقع في كرايستشيرش في نيوزيلندا. من الملحوظ وجود عدد من القطع الأثرية الخشبية التي اكتش...

 

 

Road in France You can help expand this article with text translated from the corresponding article in French. (May 2023) Click [show] for important translation instructions. Machine translation, like DeepL or Google Translate, is a useful starting point for translations, but translators must revise errors as necessary and confirm that the translation is accurate, rather than simply copy-pasting machine-translated text into the English Wikipedia. Do not translate text that appears unreli...

 

 

Security agencies of the Australian Government The Australian Intelligence Community (AIC) and the National Intelligence Community (NIC) or National Security Community of the Australian Government are the collectives of statutory intelligence agencies, policy departments, and other government agencies concerned with protecting and advancing the national security and national interests of the Commonwealth of Australia. The intelligence and security agencies of the Australian Government have ev...

Emissions of gases harmful to the climate from China This article is about greenhouse gas emissions by China, and their mitigation. For everything else related to climate change in China, see Climate change in China. China has the most total annual emissions (area of rectangle) of any nation, and has higher than average per capita emissions.[1]Cumulatively over time, emissions from China have caused more economic damage globally than any other nation except the U.S.[2] China's...

 

 

Disambiguazione – Se stai cercando il castello nel Comune di Pluhův Žďár, vedi Castello di Červená Lhota. Červená LhotaComune Červená Lhota – Veduta LocalizzazioneStato Rep. Ceca Regione Vysočina DistrettoTřebíč AmministrazioneSindacoEva Onderková TerritorioCoordinate49°17′04″N 15°48′22″E49°17′04″N, 15°48′22″E (Červená Lhota) Altitudine498 m s.l.m. Superficie7,40[1] km² Abitanti182[2] (1-1-2012) Densità24,59...

 

 

Furniture in the ancient world From left to right: Image from the Standard of Ur, Ancient Egyptian chair, Dilmunite seal, ancient Greek bed, ancient Roman couch, ancient Indian chair, ancient Chinese bronze sculpture, mushiro mat, and Aztec Pottery. Ancient furniture was made from many different materials, including reeds, wood, stone, metals, straws, and ivory. It could also be decorated in many different ways. Sometimes furniture would be covered with upholstery, upholstery being padding, s...

Disambiguazione – Se stai cercando altri personaggi con questo soprannome, vedi Filippo il bello. Filippo IV di FranciaIl gisant di Filippo IV nella Basilica di Saint-DenisRe di FranciaStemma In carica5 ottobre 1285 –29 novembre 1314(29 anni e 55 giorni) IncoronazioneCattedrale di Reims, 6 gennaio 1286 PredecessoreFilippo III SuccessoreLuigi X Re consorte di Navarracome Filippo IIn carica16 agosto 1284 –2 aprile 1305(con la consorte Giovanna I) PredecessoreGiovanna ...

 

 

This template does not require a rating on Wikipedia's content assessment scale.It is of interest to the following WikiProjects:Trains: Locomotives Trains Portal This template is within the scope of WikiProject Trains, an attempt to build a comprehensive and detailed guide to rail transport on Wikipedia. If you would like to participate, you can visit the project page, where you can join the project and/or contribute to the discussion. See also: WikiProject Trains to do list and the Trains P...