Metoda Sangera

Metoda Sangera, metoda dideoksy – jeden ze sposobów sekwencjonowania DNA, stanowiący (z różnymi modyfikacjami) podstawę odczytywania sekwencji DNA, polegający na kopiowaniu, katalizowanym przez polimerazę DNA, badanej cząsteczki DNA w warunkach in vitro.

Za opracowanie tej metody Frederick Sanger otrzymał w 1980 roku nagrodę Nobla[1].

Opis metody

Przebieg reakcji można podzielić na pięć etapów:

  1. preparatywny PCR – otrzymanie homogennego DNA
  2. denaturacja – otrzymanie jednoniciowej matrycy
  3. synteza nowych nici z użyciem dNTP i ddNTP oraz startera
  4. elektroforeza na żelu poliakrylamidowym ze stałym stężeniem środka denaturującego
  5. analiza prążków.

Reakcja przeprowadzana jest w czterech wersjach (próbówkach), w każdej z nich przy wykorzystaniu próbki tego samego badanego DNA, ale różnych odczynników. W jednym z wariantów reakcja przeprowadzana jest tak, że wszystkie jej produkty zakończone są nukleotydem adeninowym. Powstają cząsteczki DNA, których sekwencja jest wprawdzie jeszcze nieznana, ale wiadomo, że są komplementarnymi kopiami pewnych fragmentów badanego DNA, a ich ostatnim nukleotydem jest nukleotyd adeninowy. Zgodnie z zasadą komplementarności adenina ma w matrycowym DNA swój odpowiednik w formie nukleotydu tyminowego. Ponieważ w naturalnych cząsteczkach DNA każdy z czterech rodzajów nukleotydów występuje wiele razy, to fragmenty zakończone jednego rodzaju nukleotydem mogą mieć bardzo różną długość. Wszystkie jednak fragmenty i to we wszystkich wariantach doświadczenia, zaczynają się takim samym odcinkiem - starterem – dodanym na początku reakcji wraz z pozostałymi substratami. Podobnie w pozostałych wariantach reakcji otrzymuje się produkty mające różną długość, lecz zawierające starter na jednym końcu (końcu 5'), a jednego rodzaju nukleotyd na drugim końcu (końcu 3'). Cztery możliwe warianty reakcji sekwencjonowania to wariant A - prowadzący do otrzymania różnej długości produktów zawsze zakończonych nukleotydem adeninowym, C - wszystkie produkty zakończone nukleotydem cytozynowym i analogicznie warianty dla T i G.

Schemat obrazujący ideę sekwencjonowania metodą Sangera

Podczas kopiowania jednej cząsteczki DNA o tym, kiedy nastąpi przerwanie syntezy DNA, decyduje przypadek. Ponieważ każda z czterech próbówek zawiera miliony cząsteczek analizowanego DNA i każda z tych cząsteczek ulega kopiowaniu, to zgodnie z prawem wielkich liczb w próbówkach tych pojawiają się łańcuchy o wszelkich możliwych długościach (zależnych od sekwencji matrycy). Na przykład jeśli cząsteczka badanego DNA ma następującą postać: [odcinek komplementarny do startera]GATTCGA, to w reakcji typu A mogą powstać następujące trzy rodzaje produktów:

  • [starter]CTA
  • [starter]CTAA
  • [starter]CTAAGCT

DNA matrycowy (badany):

  • [odcinek komplementarny do startera]GATTCGA.
Fragment autoradiogramu uzyskanego w metodzie Sangera

Jak widać, od reguły, że w reakcji A wszystkie produkty zakończone są nukleotydem adeninowym może zdarzyć się wyjątek, ale dotyczy to tylko najdłuższych produktów, łatwych do rozpoznania (najdłuższe produkty pomija się w analizie). W próbówce wszystkie te cząsteczki są wymieszane, można je jednak uporządkować pod względem wielkości, poddając roztwory otrzymane po reakcji sekwencjonowania rozdziałowi elektroforetycznemu. Sanger zastosował do tego wysokorozdzielczą elektroforezę żelową, umożliwiającą rozróżnienie nawet łańcuchów DNA różniących się tylko jednym nukleotydem. Im mniejsze są cząsteczki DNA, tym dalej wędrują podczas doświadczenia od ujemnej elektrody. Produkty czterech wariantów reakcji sekwencjonowania nanosi się na żel tuż obok siebie, aby łatwiej było je porównywać. Po przeprowadzeniu rozdziału cząsteczek DNA trzeba je uwidocznić. Do niedawna standardowym podejściem do tego było takie przeprowadzanie reakcji sekwencjonowania, aby jej produkty były radioaktywne (znakowane izotopowo); w takim przypadku do żelu elektroforetycznego należy przyłożyć kliszę fotograficzną (rentgenowską) i przez kilkadziesiąt godzin przeprowadzać jej naświetlanie. Ostatecznie uzyskuje się autoradiogram - obraz różnych frakcji DNA w formie ciemnych prążków na wywołanej kliszy. Najmniejszym cząsteczkom odpowiadają prążki położone najdalej od jednej z krawędzi kliszy (odpowiadającej miejscu naniesienia próbek na żel). Pozostaje wtedy przeprowadzenie analizy układu frakcji DNA. W przypadku sekwencjonowania powyższego przykładowego DNA zobaczylibyśmy gdzieś na autoradiogramie prążek odpowiadający frakcji złożonej z bardzo niewielkich, szybko wędrujących cząsteczek skopiowanego DNA. Powiedzmy, że dostrzeżemy go w linii rozdziału produktów reakcji typu G. Będzie to oznaczać, że produkty sekwencjonowania zawierają nukleotyd guaninowy gdzieś w niewielkiej odległości od startera. Powinniśmy wtedy odszukać na autoradiogramie prążek odpowiadający fragmentom DNA minimalnie dłuższym od analizowanych poprzednio (minimalnie dłuższe to dłuższe o jeden nukleotyd). Przy użyciu podanej tu przykładowej sekwencji taki minimalnie dłuższy fragment zostałby znaleziony wśród produktów reakcji typu A. Kojarząc wnioski z analizy obu sąsiednich prążków dojdziemy do wniosku, że produkty sekwencjonowania w pewnej niewielkiej odległości od startera zawierają kolejno nukleotydy G i A. Podobnie następne prążki (pod względem odległości od linii naniesienia prób) zobaczylibyśmy wśród produktów reakcji typu T, znowu wśród produktów reakcji T, potem reakcji typu A, C, G, T itd. W ten sposób uzyskujemy sekwencję nici DNA komplementarnej wobec tej, która była kopiowana w reakcji sekwencjonowania, odczytujemy kolejno nukleotydy coraz dalsze od startera. Ponieważ DNA składa się z dwóch wzajemnie komplementarnych wobec siebie nici, jest to zarazem gotowa sekwencja tej drugiej nici, komplementarnej wobec skopiowanej matrycy.

Przykładowy nukleotyd naturalny: deoksyadenozynotrifosforan, dATP
Przykładowy nukleotyd terminujący syntezę DNA: dideoksyadenozynotrifosforan, ddATP

Jak wynika z powyższego, warunkiem odczytania sekwencji DNA, być może dość długiej, liczącej np. 400 - 600 nukleotydów jest wcześniejsze poznanie niewielkiego jej fragmentu (w idealnych warunkach mającego długość około 20 nukleotydów), tak by można było przygotować starter odpowiedni do tej matrycy. Problem ten jest często rozwiązywany w ten sposób, że badane, nieznane DNA wbudowuje się (przy pomocy enzymu ligazy) do pomocniczej cząsteczki DNA o znanej sekwencji, zwanej wektorem klonującym czy wektorem do klonowania DNA (genów). Przystępując do sekwencjonowania, dobiera się starter komplementarny wobec fragmentu wektora (znanego) sąsiadującego z nieznanym, badanym fragmentem DNA.

Istotnym elementem metody Sangera jest otrzymywanie populacji cząsteczek DNA będących komplementarnymi kopiami matrycy i zakończonych jednego rodzaju nukleotydem. Powielanie cząsteczki DNA matrycowego (badanego) przeprowadza się w mieszaninach reakcyjnych zawierających wszystkie substraty niezbędne dla polimerazy DNA i jeszcze jeden substrat nietypowy. Składnikami typowymi, identycznymi we wszystkich wariantach tego doświadczenia, są (poza samym matrycowym DNA i enzymem): startery, dATP, dCTP, dGTP, dTTP (2'-deoksyadenozynotrójfosforan itp., ogólnie dNTP), bufor nadający roztworowi odpowiednie pH i zawierający odpowiednie jony aktywatory - jony Mg2+. Ponadto jedna z próbówek (wariant A) zawiera nietypowy nukleotyd ddATP (2',3'-dideoksyadenozynotrójfosforan). Kiedy polimeraza DNA odczytuje w matrycy nukleotyd tyminowy, to w nowo syntetyzowanej nici wbudowuje komplementarny nukleotyd adeninowy wykorzystując dATP jako substrat. Ponieważ w roztworze znajduje się także analog dideksy, ddATP, a polimeraza nie rozróżnia tych dwóch związków, do niektórych nowych łańcuchów DNA wbudowany zostaje nukleotyd zmodyfikowany. O tym który z tych nukleotydów zostanie przez enzym wykorzystany na danym etapie kopiowania decyduje przypadek. Jeśli przyłączony zostanie naturalny nukleotyd adeninowy, to polimeraza może kontynuować syntezę DNA. Jeśli wbudowana zostanie dideoksyadenozynofosforan, to proces syntezy zostaje przerwany, gdyż analog ten nie ma w pozycji 3' grupy hydroksylowej umożliwiającej przyłączenie kolejnego nukleotydu. Podobnie mieszanina reakcyjna typu C zawiera poza dNTP, także ddCTP, mieszanina typu G - dNTP i ddGTP, a roztwór typu T - dNTP i ddTTP, a synteza łańcuchów DNA w tych mieszaninach przerwana gdy polimeraza wbuduje do niego dideoksynukleotyd.

Modyfikacje metody Sangera
  • sekwencjonowanie cykliczne
  • znakowanie fluorescencyjne.

Zobacz też

Przypisy

  1. Sanger, F, Nicklen, S, Coulson, AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”. 74. 12, s. 5463–5467, 1977. PMID: 431765. 

Bibliografia

  • Robert K. Murray (red.): Biochemia Harpera. Warszawa: PZWL, 2005. ISBN 83-200-3347-0.

Read other articles:

Disambiguazione – Se stai cercando altri significati, vedi 1892 (disambigua). XVIII secolo · XIX secolo · XX secolo Anni 1870 · Anni 1880 · Anni 1890 · Anni 1900 · Anni 1910 1888 · 1889 · 1890 · 1891 · 1892 · 1893 · 1894 · 1895 · 1896 Il 1892 (MDCCCXCII in numeri romani) è un anno bisestile del XIX secolo. 1892 negli altri calendari Calendario gregoriano 1892 Ab Urbe condita 2645 (MMDCXLV) Cal...

 

Halaman ini berisi artikel tentang kota di Kosovo. Untuk distrik dengan nama yang sama, lihat Distrik Gjilan. Menara jam di Gjilan Gjilan[a] adalah kota dan munisipalitas di Kosovo.[b] Kota ini adalah ibu kota munisipalitas dan Distrik Gjilan. Munisipalitas Gjilan di Kosovo Gjilan berjarak 46 km dari Pristina, 27 km dari Kamenica, 22 km dari Vitina, dan 25 km dari Novo Brdo.[1] Nama Sejarawan Ottoman, Evliva Çelebi, menulis Morava untuk mereferensi...

 

Arkamelvi Karmani Pa Sahli Tk. III Kasad Bidang Wassus dan LHPetahanaMulai menjabat 9 November 2023 PendahuluHendrikus Joko RiantoPenggantiPetahanaKepala Staf Komando Garnisun Tetap I/JakartaMasa jabatan29 Maret 2023 – 9 November 2023 PendahuluRano TilaarPenggantiEdi SaputraDirektur Latihan Kodiklat TNIMasa jabatan25 September 2020 – 29 Maret 2023 PendahuluTri MartonoPenggantiKhairul Anwar Mandailing Informasi pribadiLahir10 Februari 1967 (umur 57)Jakarta, Indon...

Liste der Filmjahre ◄◄ | ◄ | 1962 | 1963 | 1964 | 1965 | Filmjahr 1966 | 1967 | 1968 | 1969 | 1970 | ► | ►► Weitere Ereignisse Filmjahr 1966 Am 15. Dezember 1966 starb der US-amerikanische Filmproduzent und Trickfilmzeichner Walt Disney. Inhaltsverzeichnis 1 Ereignisse 2 Erfolgreichste Filme 2.1 Top 10 in Deutschland 2.2 Top 10 in den USA 2.3 Erfolgreichste Filme in Asien 3 Filmpreise 3.1 Golden Globe Award 3.2 Academy A...

 

American heiress, socialite, and philanthropist Sunny von BülowBornMartha Sharp Crawford(1932-09-01)September 1, 1932Manassas, Virginia, U.S.DiedDecember 6, 2008(2008-12-06) (aged 76)Manhattan, New York City, New York, U.S.OccupationSocialiteSpouses Prince Alfred von Auersperg ​ ​(m. 1957; div. 1965)​ Claus von Bülow ​ ​(m. 1966; div. 1987)​ Children3, including Cosima von Bülow PavoncelliP...

 

Nadia PurwokoLahirNadia Sristi Purwoko23 Januari 1992 (umur 32)Kota Bengkulu, Bengkulu, IndonesiaNama lainNadia PurwokoAlmamaterUniversitas IndonesiaPekerjaanPengacaraModelRatu kecantikanTinggi178 cm (5 ft 10 in)Pemenang kontes kecantikanGelarMiss Grand Indonesia 2018Warna rambutHitamWarna mataHitamKompetisiutama None Jakarta 2010(Harapan II) Miss Grand Indonesia 2018(Pemenang) Miss Grand International 2018(Runner-up 2)(Best in Social Media) Nadia Sristi Purwoko (lah...

1992 protests in Sarajevo, Bosnia and Herzegovina Anti-war protests in SarajevoPart of the Siege of Sarajevo and the Bosnian WarThousands of protesters in front of the parliament building.Date5–6 April 1992LocationSarajevo, Republic of Bosnia and HerzegovinaCaused by Bosnian Serb barricades set up around Sarajevo Opposition to Serbian nationalist militias Opposition to the pro-Yugoslav government Goals Military withdrawal of the JNA forces and SDS paramilitary troops from Bosnia and Herzego...

 

Non-verbal communication This article has multiple issues. Please help improve it or discuss these issues on the talk page. (Learn how and when to remove these template messages) This article relies excessively on references to primary sources. Please improve this article by adding secondary or tertiary sources. Find sources: U.S. Army hand and arm signals – news · newspapers · books · scholar · JSTOR (December 2015) (Learn how and when to remove this ...

 

العلاقات التشيكية السلوفينية التشيك سلوفينيا   التشيك   سلوفينيا تعديل مصدري - تعديل   العلاقات التشيكية السلوفينية هي العلاقات الثنائية التي تجمع بين التشيك وسلوفينيا.[1][2][3][4][5] مقارنة بين البلدين هذه مقارنة عامة ومرجعية للدولتين: وجه ال...

Medical conditionAcrodermatitis enteropathicaOther namesAcrodermatitis enteropathica, zinc deficiency type[1]Acrodermatitis enteropathica inheritanceSpecialtyEndocrinology SymptomsDry skin, Emotional lability, Blistering of skin[2]CausesMutation of the SLC39A4 gene[3]Diagnostic methodSkin biopsy, Plasma zinc level[3]TreatmentDietary zinc supplementation[1] Acrodermatitis enteropathica is an autosomal recessive metabolic disorder affecting the uptak...

 

Cet article est une ébauche concernant une intercommunalité française et la Sarthe. Vous pouvez partager vos connaissances en l’améliorant (comment ?) ; pour plus d’indications, visitez le Projet des intercommunalités françaises. Communauté de communes Haute Sarthe Alpes Mancelles Administration Pays France Région Pays de la Loire Département Sarthe Forme Communauté de communes Siège Fresnay-sur-Sarthe Communes 38 Président Philippe Martin (SE) Date de création 1er...

 

Contemporary R&BOrigini stilisticheR&BHip hopPopSoulFunk Origini culturalianni ottanta in Nord America: New York, Los Angeles, Atlanta, Chicago, Houston, Montréal, Toronto. Strumenti tipicivoce, batteria, pianoforte, tastiera, sintetizzatore, sequencer, vocoder Popolaritàriscuote un gran successo sin dalla sua nascita, specialmente nei paesi anglofoni I migliori anni di questo genere sono stati gli anni 90 e 2000 SottogeneriHip hop soul - Neo soul - New jack swing - Crunk & B Ge...

Major League Baseball team season 2016 Tampa Bay RaysLeagueAmerican LeagueDivisionEastBallparkTropicana FieldCitySt. Petersburg, FloridaRecord68–94 (.420)Divisional place5thOwnersStuart SternbergManagersKevin CashTelevisionSun Sports(Dewayne Staats, Brian Anderson, Todd Kalas)RadioTampa Bay Rays Radio Network (English)(Andy Freed, Dave Wills, Todd Kalas)WGES (Spanish)(Ricardo Taveras, Enrique Oliu) ← 2015 Seasons 2017 → The 2016 Tampa Bay Rays season was the Rays...

 

「アプリケーション」はこの項目へ転送されています。英語の意味については「wikt:応用」、「wikt:application」をご覧ください。 この記事には複数の問題があります。改善やノートページでの議論にご協力ください。 出典がまったく示されていないか不十分です。内容に関する文献や情報源が必要です。(2018年4月) 古い情報を更新する必要があります。(2021年3月)出...

 

يفتقر محتوى هذه المقالة إلى الاستشهاد بمصادر. فضلاً، ساهم في تطوير هذه المقالة من خلال إضافة مصادر موثوق بها. أي معلومات غير موثقة يمكن التشكيك بها وإزالتها. (نوفمبر 2019) كأس الكؤوس الإفريقية 1979 تفاصيل الموسم كأس الكؤوس الإفريقية  النسخة 5  المنظم الاتحاد الإفريقي لكرة �...

Évêché de Verdun Principauté épiscopale de Verdun Fürstbistum Wirten Onderdeel van het Heilige Roomse Rijk ←  10e eeuw – 1552/1648  → Kaart 15e eeuw Verdun in violet Algemene gegevens Hoofdstad Verdun Talen Frans, Latijn, Duits Religie(s) Rooms-katholiek na 1552 protestant Het prinsbisdom Verdun (Duits: Fürstbistum Wirten) was een tot de Boven-Rijnse Kreits behorend bisdom binnen het Heilige Roomse Rijk Geschiedenis Omstreeks 350 stichtte Sanctinus het bisdom...

 

US Supreme Court justice from 1858 to 1881 Justice Clifford redirects here. For other uses, see Justice Clifford (disambiguation). Attorney General Clifford redirects here. For the Attorney General of Massachusetts, see John H. Clifford. This article needs additional citations for verification. Please help improve this article by adding citations to reliable sources. Unsourced material may be challenged and removed.Find sources: Nathan Clifford – news · newspapers ...

 

Bus rel Uerdingen masih beroperasi di Jerman. Bus rel (railbus) adalah variasi dari kereta rel, yang dalam pembuatannya menggunakan bahan yang lebih ringan, menggunakan prinsip-prinsip yang dipakai dalam pembuatan bus (terutama dalam konstruksi dan tata ruang), dan dirancang untuk digunakan pada jalur rel yang kurang padat. Kendaraan ini dapat bergerak sendiri-sendiri ataupun dirangkaikan. Bus rel dapat pula menggunakan ban, bukan bogie sebagaimana lazimnya kereta api, tetapi bergerak di jalu...

جزء من سلسلة مقالات حولنظم الحكومات أشكال السلطة انفصالية دولة مرتبطة دومينيون مشيخة محمية فدرالية كونفدرالية تفويض السلطات دولة اتحادية فوق وطنية إمبراطورية الهيمنة دولة مركزية التقسيم الإداري مصدر السلطة ديمقراطية(سلطة الأكثرية) ديمارية مباشرة ليبرالية تمثيلية اجتم...

 

Voce principale: Supercoppa italiana. Supercoppa italiana 1988 Competizione Supercoppa italiana Sport Calcio Edizione 1ª Organizzatore Lega Nazionale Professionisti Date 14 giugno 1989 Luogo  ItaliaMilano Partecipanti 2 Formula gara unica Impianto/i Stadio Giuseppe Meazza Risultati Vincitore Milan(1º titolo) Secondo Sampdoria Statistiche Gol segnati 4 Pubblico 19 412 I rossoneri festeggiano con il trofeo Cronologia della competizione 1989 Manuale La Supercoppa italiana 1988 è st...