אייזנברג נולד ברובע קווינס בניו יורק שבארצות הברית, למשפחה יהודית ממוצא פולני ואוקראיני. הוריו הם איימי (לבית פישמן) ובארי אייזנברג. יש לו אחות צעירה בשם האלי אייזנברג (אנ'), שגם היא שחקנית. אייזנברג חגג בר מצווה באיחור של מספר שנים, הוא צם בימי כיפור, ויש לו גם קרובי משפחה רחוקים בישראל.[1]
את תפקידו הראשון בסרט קיבל אייזנברג ב-2002 בדרמה "מועדון הקיסר".
ב-2005 שיחק אייזנברג במותחן האימה של וס קרייבן "הקללה", בו מגלם את ג'ימי אשר נרדף ומותקף ביחד עם אחותו אלי (כריסטינה ריצ'י) בידי איש זאב. כשג'ימי ואחותו ננשכים על ידיו הם יוצאים למירוץ נגד הזמן כדי למנוע את הקללה ולהפוך לאנשי זאב.
כמו כן שיחק אייזנברג בדרמה "חיים בין השורות", שם שיחק את וולט ברקמן, נער בן 16 שהוריו נפרדים.
ב-2007 הופיע אייזנברג במותחן הריגול "מבוקש" בו גילם כתב צעיר חסר ניסיון בשם בנג'מין שיוצא ביחד עם הכתב הצבאי סיימון האנט (ריצ'רד גיר) ועם הצלם דאק (טראנס הווארד) למסע סיקור ברפובליקה של בוסניה אחר פושע המלחמה מס' 1 באזור ראדוסלאב בוגדנוביץ'. אך כאשר השלושה נחשבים בטעות לסוכני CIA, הם הופכים בעצמם למטרת חיסול.
בשנת 2009 הופיע אייזנברג בתפקיד ראשי בקומדיית האימה "ברוכים הבאים לזומבילנד", בסרט מגלם אייזנברג את הגיבור קולומבוס, תלמיד מכללה פחדן בטקסס, העושה את דרכו לביתו שבקולומבוס אוהיו בעולם בו פרצה מגפה שהפכה את רוב האנושות לזומבים, ובשנת 2019 שב לככב בסרט ההמשך "זומבילנד: ירייה כפולה".
ב-2013 כיכב בתור ג'י. דניאל אטלס, אחד מארבעת הפרשים בסרט "האשליה". ב-2016 שב לגלם את דמותו בסרט ההמשך "האשליה 2".
במרץ 2013 הועלה בבכורה עולמית המחזה השני שכתב אייזנברג, "סיפור ישן־חדש", ושנקרא במקור The Revisionist ("הרוויזיוניסט"), בהפקת תיאטרון ראטלסטיק למחזאים בניו יורק והיה במהרה ללהיט בקופות. הוא בוים בידי קיפ פגאן, ואייזנברג שיחק בו את דייוויד, לצד השחקנית הבריטית ונסה רדגרייב, שגילמה את מריה, ודניאל אורסקס ששיחק את זנון, נהג מונית וידיד של מריה. המבקרים שיבחו בעיקר את משחקה של רדגרייב ואילו אייזנברג ספג ביקורת צוננת יותר. אייזנברג ביקר בישראל לרגל העלאת בכורת המחזה בתיאטרון בית לסין ב-24 ביולי2014.[2]
בשנים 2002–2012 היה בזוגיות עם עוזרת ההפקה, אנה סטראוט. בשנים 2013–2015 היה בזוגיות עם השחקנית האוסטרלית, מיה וסיקובסקה. אולם לאחר מכן חזר לאנה סטראוט, בדצמבר 2016 נולד להם בן, וב-2017 הם נישאו.
הוא סיפר בריאיון ל-ynet על כך שב-2014 הגיע לביקור בישראל במהלך מבצע צוק איתן, וטען שהרגיש בטוח מאוד בארץ, כל זאת לכבוד הבכורה של הפקה המבוססת על מחזה שכתב "סיפור ישן חדש" שהועלה בתיאטרון בית ליסין באותה עת.[1]
^"אני נוגע בקצות האצבעות שלי בצורה מוזרה; אני לא דורך על חריצים ברצפה; אם אני עובר לרצפה מסוג שונה - משטיח לבטון, או מבטון לפרקט, או מפרקט לבטון, כל משטח חדש - אני חייב לוודא ששתי הרגליים שלי יגעו ברצפה לפני שאני עובר למשטח החדש. אז הרבה פעמים אני מהסס לפני שאני נכנס לחדר חדש"