Os cromosomas artificiais humanos (CAH ou máis coñecidos polas siglas inglesas HAC) son vectores de transferencia para grandes fragmentos de ADN. Están en desenvolvemento desde a década de 1990, tras o éxito dos cromosomas artificiais de lévedoYAC e, máis recentemente, de bacterias BAC e os PAC derivados do plásmido P1. Os YAC e PAC utilízanse para clonar grandes loci genómicos incluídas as rexiós reguladoras, e téñense utilizado moito para xerar mapas físicos do xenoma humano, identificar xenes de enfermidades por clonación posicional, e para xerar ratos transxénicos para estudos de expresión xénica.
Funcións dos cromosomas artificiais humanos
Representación da transferencia mediada por microcélulas dun cromosoma humano a unha célula de rato.
Os HAC son vectores de transferencia de xenes que se comportan e se constrúen como os cromosomas humanos normais. Poden replicarse, segregan de maneira estable e usan os compoñentes funcionais da célula humana, evitando así os problemas de integración no xenoma do hóspede; por tanto, poden introducirse noutras células humanas sen problema. Son moi útiles para estudar a expresión e entender a función dos cromosomas, xa que ofrecen a posibilidade de expresar grandes fragmentos de ADN humano noutros modelos animais.
A combinación de fragmentos de cromosomas ou os cromosomas artificiais humanos por transferencia mediada por microcélulas facilitou o mapeo de xenes humanos e diversos estudos xenéticos. A recente aparición da enxeñaría de tecidos nai baseada en células abriu novas vías para as terapias xénicas e celulares. Agora a tarefa en marcha é o desenvolvemento de vectores seguros e eficaces que poidan introducir xenes terapéuticos en células troncais ou nais e manter a expresión reguladora específica a longo prazo destes xenes. Aínda que segue sendo necesario mellorar a eficiencia da transferencia, os HACs posúen varias características que se requiren para un bo vector de terapia xénica, incluído o seu mantemento episomal estable na célula e a capacidade de inserción de xenes de gran tamaño. Ademais, os HACs tamén poden conter loci xenómicos con elementos reguladores, que permiten a expresión de transxenes nun ambiente xenético semellante ao do cromosoma natural.
Construción dos cromosomas artificiais humanos
Á hora de crear os HAC, o traballo céntrase na determinación dos requisitos para a súa formación. O máis importante na definición das secuencias dos HAC, é a función do centrómero e a identificación funcional do cinetocoro. O principal elemento funcional do centrómero humano definiuse como α satélite ou ADN alfoide .[1] Tamén se determinou o tamaño mínimo da matriz alfoide compatible cun centrómero funcional.
Os HAC son minicromosomas exóxenos creados artificialmente. A maioría xéranse seguindo dous enfoques diferentes, xa sexa "un enfoque de arriba cara a abaixo" (enxeñaría de cromosomas, fragmentación dun cromosoma natural), ou "un enfoque de abaixo cara a arriba" (creación de novo do cromosoma artificial).
Fragmentación dun cromosoma natural
Representación da creación dun cromosoma artificial humano por fragmentación dun cromosoma natural.
O primeiro enfoque, desenvolvido en 1991, foi a fragmentación de cromosomas asociados a telómeros (TACF) ou telómeros TDT. Esta técnica implica a fragmentación sucesiva dun cromosoma humano específico de acollida en pequenos minicromosomas, utilizando un vector de orientación que abrangue un segmento terminal dos telómeros, un marcador xenético, e, ás veces unha rexión de homoloxía co cromosoma obxectivo. Os minicromosomas resultantes segregan de forma autónoma normalmente. Este método tivo éxito na fragmentación dos cromosomas humanos X e Y. Con este enfoque tamén se indicou que son necesarias un mínimo de 100 kb de ADN alfoide para a estabilidade en cromosomas humanos.
Os HACs tamén poden construírse por medio de técnicas de fragmentación dos telómeros dun cromosoma en liñas celulares de polo hiper-recombinoxénicas, DT40, aínda que a eficiencia é similar á dos HACs de creación de novo, existen problemas que necesitan resolverse. Con este enfoque pódense xerar mini-cromosomas liñais estables, que varían en tamaño desde 0,5 ata 10 Mb. Estes mini-cromosomas manteñen un centrómero normal e estable durante a mitose nas células humanas só con reordenamentos menores. Porén, estes HACs requiren un sitio de clonación para inserir xenes exóxenos.
Para construír este tipo de vectores, un contido substancial do brazo[2]p ou q dun cromosoma humano vai diminuíndose a través de dúas roldas de truncamento telomérico en dito cromosoma. Despois, unha secuencia loxP única (unha secuencia diana para a recombinación homóloga da recombinaseCre) cun xene neo sen o promotor introdúcese no brazo q. Por tanto, polo menos en teoría, calquera ADN circular (BAC, PAC, ou YAC circular) cun sitio loxP e un promotor pode restaurar a expresión xénica mediada por neo-Cre por medio da inserción no sitio loxP específico do HAC. Esta técnica experimentouse no cromosoma 21 humano, creando un vector HAC de 4,5 Mb de tamaño, con tres características útiles para ser un bo vector xénico:
No sitio loxP pódense introducir unha ou varias copias dun xene de interese.
Síntese de novo
Estratexia para incorporar xenes en cromosomas artificiais humanos.
Consiste en xerar cromosomas artificiais por medio da introdución de clonado centromérico e telomérico en células humanas en cultivo.
O propósito inicial de xerar HAC de novo é mellorar a comprensión dos requisitos da estrutura do cromosoma e a súa función, en particular o papel do centrómero. O centrómero é unha complexa estrutura cromosómica que ten unha función mecánica no cromosoma, xa que serve como un sitio para a montaxe da separación dos cromosomas mediada polos microtúbulos do cinetocoro durante a división celular.
A montaxe de novo do HAC foi desenvolvida en 1997 por Willard e o seu grupo de traballo. En células de fibrosarcoma humanas HT1080 introducíuse unha combinación de ADN humano sintético α-satélite, ADN humano telomérico xerado pola reacción en cadea da polimerase (PCR), e ADN xenómico humano ao chou para montar un cromosoma artificial humano liñal exóxeno. Posteriormente, outros grupos tamén informaron da xeración exitosa de HACs de novo utilizando células HT1080, conseguindo o precursor da transfección de ADN humano α-satélite e os telómeros clonados de forma liñal en YACs, ou de forma circular en cromosomas artificiais bacterianos (BAC) ou fagos P1 (PAC).
Na maioría dos casos, os HACs xerados de novo son circulares, cun tamaño entre 1 e 10 Mb, e demostrouse que son mitoticamente estables. Tamén se desenvolveron outros sistemas para crear rapidamente cromosomas artificiais humanos baseados en cromosomas artificiais bacterianos utilizando un sistema de recombinación do virus bacteriófago λ, ou usando un transposón Tn5 bacteriano modificado. A utilización invasiva do sistema de Escherichia coli tamén pode facilitar a formación de cromosomas artificiais humanos de novo.
Limitacións da síntese de novo
Hai varios factores que limitan a aplicación dos HACs creados de novo como vectores de xenes.
En primeiro lugar, o problema máis crítico é a súa estrutura e a relación impredicible entre o ADN de entrada e o HAC resultante, especialmente en termos do seu tamaño e composición. Estes HACs varían en tamaño, desde 1 ata 10 Mb, o que suxire que as reorganizacións e amplificacións do complexo se producen durante o proceso de formación de mini-cromosomas.
En segundo lugar, o ADN de entrada podería integrarse no xenoma do hóspede.
En terceiro lugar, a formación de HACs tivo éxito en limitadas liñas celulares humanas, como as células de fibrosarcoma HT1080.
Usos dos cromosomas artificiais humanos
Un dos usos principais dos cromosomas artificiais humanos pola súa potencialidade como vectores de expresión xenética son os tratamentos de terapia xénica. A análise da expresión espacial e temporal axeitada do HAC en ratos transxénicos indica a capacidade destes vectores para o seu uso en terapia xénica somática.
Uso de HACs como vectores de transferencia
Unha solución ás cuestións xurdidas do uso de sistemas de vectores virais dispoñibles na actualidade é o uso de cromosomas artificiais humanos (HAC), porque se replican e segregan independentemente no xenoma do hóspede como cromosomas naturais.
Os HACs poden imitar fielmente o patrón normal da expresión xénica, xa que poden conter loci xenómicos completos, incluíndo elementos de regulación "corrente arriba" e "corrente abaixo". Ademais, por mor da súa existencia episomal (insírense en distintas partes do xenoma), moitas complicacións, tales como o silenciamiento de xenes terapéuticos ou oncoxénese derivadas da integración en sitios desfavorables, poden reducirse ao mínimo.
Teñen un uso potencial para tratar enfermidades producidas por deficiencias xénicas, como a diabetes insulino-dependente, creando HACs que leven o transxene da proinsulina e fagan que a célula do humano adulto poida xerar a súa propia insulina.
Outros posibles usos dos HACs
Poden usarse para manter a corrección a longo prazo dos xenes defectuosos debido a que estes vectores son estables durante moitas divisións celulares, polo menos nas células humanas.
Tamén poden complementar os fenotipos mutantes e recuperar knockouts de xenes en modelos de rato (rato knockout).
Harrington, J. J., G. V. Bokkelen, R. W. Mays, K. Gustashaw, y H. F. Willard. 1997. Formation of de novo centromeres and construction of first-generation human artificial microchromosomes. Nat Genet 15:345-355. doi: 10.1038/ng0497-345.
Hoshiya, H., Y. Kazuki, S. Abe, M. Takiguchi, N. Kajitani, Y. Watanabe, T. Yoshino, Y. Shirayoshi, K. Higaki, G. Messina, G. Cossu, y M. Oshimura. 2008. A highly Stable and Nonintegrated Human Artificial Chromosome (HAC) Containing the 2.4 Mb Entire Human Dystrophin Gene. Mol Ther 17:309-317. Recuperado Marzo 24, 2010, a partir de http://dx.doi.org/10.1038/mt.2008.253.
Ikeno, M., H. [. Inagaki, K. Nagata, M. Morita, H. [. Ichinose, y T. Okazaki. 2002. Generation of human artificial chromosomes expressing naturally controlled guanosine triphosphate cyclohydrolase I gene. Genes to Cells 7:1021-1032. doi: 10.1046/j.1365-2443.2002.00580.x.
Katoh, M., F. Ayabe, S. Norikane, T. Okada, H. Masumoto, S. Horike, Y. Shirayoshi, y M. Oshimura. 2004. Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochemical and Biophysical Research Communications 321:280-290. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.06.145.
Kawahara, M., T. Inoue, X. Ren, T. Sogo, H. Yamada, M. Katoh, H. Ueda, M. Oshimura, y T. Nagamune. 2007. Antigen-mediated growth control of hybridoma cells via a human artificial chromosome. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1770:206-212. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbagen.2006.10.014.
Kotzamanis, G., W. Cheung, H. Abdulrazzak, S. Perez-Luz, S. Howe, H. Cooke, y C. Huxley. 2005. Construction of human artificial chromosome vectors by recombineering. Gene 351:29-38. doi: doi: DOI: 10.1016/j.gene.2005.01.017.
Larin, Z., y J. E. Mej�a. 2002. Advances in human artificial chromosome technology. Trends in Genetics 18:313-319. doi: doi: DOI: 10.1016/S0168-9525(02)02679-3.
Otsuki, A., C. G. Tahimic, N. Tomimatsu, M. Katoh, D. J. Chen, A. Kurimasa, y M. Oshimura. 2005. Construction of a novel expression system on a human artificial chromosome. Biochemical and Biophysical Research Communications 329:1018-1025. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.02.079.
Suda, T., M. Katoh, M. Hiratsuka, M. Takiguchi, Y. Kazuki, T. Inoue, y M. Oshimura. 2006. Heat-regulated production and secretion of insulin from a human artificial chromosome vector. Biochemical and Biophysical Research Communications 340:1053-1061. doi: doi: DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.12.106.
Tsuduki, T., M. Nakano, N. Yasuoka, S. Yamazaki, T. Okada, Y. Okamoto, y H. Masumoto. 2006. An Artificially Constructed De Novo Human Chromosome Behaves Almost Identically to Its Natural Counterpart during Metaphase and Anaphase in Living Cells. Mol. Cell. Biol. 26:7682-7695. doi: 10.1128/MCB.00355-06.
