Bien que né à New Liskeard, en Ontario d'un père franco-ontarien et d'une mère québécoise, il passe une grande partie de sa jeunesse à Amos, en Abitibi-Témiscamingue. De onze à quatorze ans, il vit à Kapuskasing, en Ontario. Après le divorce des parents, avec sa mère, sa sœur, et son frère, la famille Dupuis déménage dans le quartier Sainte-Rose à Laval, au nord de Montréal.
Son interprétation d'Ovila Pronovost dans Les Filles de Caleb (1990-1991) en fait une vedette de la télévision québécoise. Fiction tirée du roman éponyme d'Arlette Cousture, cette série télévisée se déroule dans le milieu rural, au début du XXe siècle, une période historique importante du Québec. Elle rencontre un très gros succès populaire. Il apparaît de nouveau à la télévision dans la série télévisée Scoop (1991-1995), la mini-sérieMaurice Richard (1999) et la série d'espionnage canadienne-anglaise Nikita (La Femme Nikita, 1997-2001), inspirée par Nikita, le thrillerfranco-italien réalisé par Luc Besson en 1990.
L'année 2008 démarre avec le retour de Roy Dupuis sur les planches: après 14 ans d'absence, dans la pièce Blasted de la dramaturge britannique Sarah Kane[2] (traduite par Jean-Marc Dalpé et mise en scène par Brigitte Haentjens), qu'il renoue avec le théâtre aux côtés de Céline Bonnier et Paul Ahmarani.
