Giovanna Mezzogiorno est la fille des comédiens Vittorio Mezzogiorno et Cecilia Sacchi. Après la mort de son père, elle a vécu pendant deux ans à Paris après des études de cinéma, et y travaille l'art dramatique auprès d'Ariane Mnouchkine et du centre de créations théâtrales de l'école de Peter Brook[1], avec lequel elle joue « Ophélia » dans la pièce Qui est là[2].
Elle débute à la télévision en jouant dans le téléfilm Aimer à tout prix (Più leggero non basta) d'Elisabetta Lodoli en 1999. Elle apparaît dans la mini-série Les Misérables, en 2000, et se révèle, en 2001, dans le film de Gabriele Muccino nommé Juste un baiser (L'ultimo bacio) qui relate l’histoire d’un couple dans la trentaine qui se brise face à la routine et aux mensonges[2].
En 2003, le film La Fenêtre d'en face (La finestra di fronte) de Ferzan Ozpetek, dans lequel elle interprète le rôle de Giovanna, femme mariée et heureuse qui, à la suite de l’apparition dans sa vie d’un vieux monsieur aux souvenirs étranges, va se mêler d’amitié avec le voisin de palier — obtient un succès commercial et critique important. Pour ce rôle, elle remporte le Prix David di Donatello, le Ruban d'argent, le Globo d'oro et le Ciak d'oro de la meilleure actrice principale. Après ce succès, elle est, en 2004, à l’affiche de trois films dont la comédie française Au secours, j'ai 30 ans ! de Marie-Anne Chazel[2].
En 2010, elle est membre du jury dirigé par Tim Burton au Festival de Cannes 2010. Elle apparaît la même année dans trois films italiens avant de prendre une pause, donnant naissance en 2011 à des jumeaux, Leone et Zeno[2].
En 2023, elle a fait ses débuts en tant que réalisatrice avec le court métrage Unfitting, qui relate l'histoire dans le milieu du cinéma d'une actrice qui a pris de l'embonpoint[4].
Le 6 juin 2014, le consul général de France et la directrice de l’Institut français lui ont remis à Milan les insignes de Chevalier de l'Ordre des Arts et des Lettres[5].
