Στο πρωτάθλημα της Β΄ κατηγορίας 2000-01 συμμετείχαν 14 ομάδες. Όλες οι ομάδες αναμετρήθηκαν αναμεταξύ τους από δύο φορές, μία εντός και μία εκτός έδρας. Πρωταθλήτρια ανακηρύχτηκε η ομάδα που συγκέντρωσε τους περισσότερους βαθμούς. Οι τρεις πρώτες ομάδες προβιβάστηκαν στο πρωτάθλημα Α΄ κατηγορίας 2001-02. Οι τρεις τελευταίες ομάδες υποβιβάστηκαν στο πρωτάθλημα Γ΄ κατηγορίας 2001-02.
Σύστημα βαθμολόγησης
Η νίκη βαθμολογείτο με 3 βαθμούς και η ισοπαλία με 1 βαθμό ενώ η ήττα δεν έδινε κανένα βαθμό.
Λόγω της ενοποίησης του Ευαγόρα Πάφου (συμμετείχε στη Β΄ κατηγορία) με τον ΑΠΟΠ Πάφου (συμμετείχε στην Α΄ κατηγορία), με τη δημιουργία της ΑΕΠ Πάφου (που πήρε τη θέση του ΑΠΟΠ στην Α΄ κατηγορία), δημιουργήθηκε μια κενή θέση για το πρωτάθλημα Β΄ κατηγορίας 2000-01. Για το λόγο αυτό διεξήχθησαν αγώνες μπαράζ στους οποίους συμμετείχαν οι τρεις τελευταίες στη βαθμολογία ομάδες του πρωταθλήματος Β΄ κατηγορίας 1999-00 και η τέταρτη στη βαθμολογία ομάδα της Γ΄ κατηγορίας 1999-00. Η νικήτρια θα συμμετείχε στο πρωτάθλημα Β΄ κατηγορίας 2000-01. Πρώτη στην τελική κατάταξη των μπαράζ αναδείχθηκε η Αναγέννηση Γερμασόγειας, η οποία είχε τερματίσει στη 13η θέση του πρωταθλήματος Β΄ κατηγορίας 1999-00, οπόταν μόνο δύο ομάδες υποβιβάστηκαν στην Γ΄ κατηγορία 2000-01.
Την περίοδο 1958-59 το πρωτάθλημα δεν διεξήχθη λόγω της έκρυθμης κατάστασης στην Κύπρο ως αποτέλεσμα του αγώνα της ΕΟΚΑ. Την περίοδο 1963-64 το πρωτάθλημα δεν διεξήχθη λόγω των δικοινοτικών διαταραχών. Την περίοδο 1974-75 πραγματοποιήθηκε Ειδικό μικτό πρωτάθλημα Β΄ - Γ΄ κατηγορίας ο πρωταθλητής του οποίου θεωρείται πρωταθλητής Β΄ κατηγορίας 1974-75. Την περίοδο 2019-20 το πρωτάθλημα διακόπηκε λόγω της Πανδημίας του κορονοϊού.