Xa lộ Liên tiểu bang 65 bắt đầu tại thành phố Mobile tại điểm giao cắt với Xa lộ Liên tiểu bang 10. Từ I-10, I-65 đi về phía tây phố chính của thành phố Mobile và qua khác khu ngoại ô phía bắc trước khi quay về hướng đông bắc để hướng về Montgomery. Từ thủ phủ tiểu bang, I-65 đi lên phía bắc, tránh đi qua thành phố Prattville và thành phố Clanton trước khi đi qua Vùng đô thị Birmingham, Alabama. Từ lối ra số 242 đến 290, xa lộ này có 6 làn xe. Một đoạn chạy qua thành phố Birmingham có biệt danh là "Malfunction Junction" (có nghĩa là giao điểm bế tắc) vì có vô số vụ tai nạn tại đây.
Trong trường hợp có di tản vì bão trên duyên hải tiểu bang Alabama, I-65 có thể được chuyển đổi thành một con đường di tản. Khi đó tất cả các làn xe hai bên dải phân cách đều đi một chiều lên hướng bắc từ thành phố Mobile đến Montgomery.
Từ Birmingham, I-65 tiếp tục đi về hướng bắc đến Cullman và Decatur. Ngay phía bắc phố chính thành phố Birmingham, hai dự án về xa lộ liên tiểu bang lớn đang trong các giai đoạn triển khai khác nhau. Xa lộ Liên tiểu bang 22 sẽ nối với I-65 tại lối ra số 265. Việc xây dựng nút giao thông này bắt đầu vào tháng 8 năm 2009. Việc mở rộng I-65 cả hai bên phía đang được tiến hành từ năm 2007. Xa lộ Liên tiểu bang 22 sẽ cung cấp đường kết nối trực tiếp giữa Birmingham và Memphis, Tennessee.
Khoảng vài dặm phía bắc I-22 sẽ có một nút giao thông mới (lối ra số 274) và sẽ được đặt tên là Xa lộ Liên tiểu bang 422. Xa lộ vòng này sẽ nối I-65 với I-59 phía đông bắc Birmingham và I-20/I-59 tây nam Birmingham. Nó sẽ phục vụ như một xa lộ liên tiểu bang đi tránh qua thành phố Birmingham, tăng cường cho Xa lộ Liên tiểu bang 459 hiện có, đang cung cấp con đường tránh thành phố ở phía nam Birmingham.
Năm 2004, sau khi tổng thống Ronald Reagan qua đời, một đoạn dài của I-65 từ Quận Jefferson đến Quận Limestone được đặt tên là Xa lộ Tưởng niệm Ronald Reagan. Biển dấu cắm tại đầu phía bắc của đoạn này gồm có lời nói trích từ bài diễn văn của tổng thống Reagan tại Trung tâm Bể bơi Point Mallard trong thành phố Decatur gần đó vào ngày 4 tháng 7 năm 1984.
Nhà máy sản xuất xe hơi mới của công ty Hyundai tại Montgomery nằm phía ngoài I-65. Có thể đến đó bằng Lối ra Pintlala-Hope Hull (số 164). Nhà máy sản xuất xe hơi Mercedes Benz trong Quận Tuscaloosa cũng có thể đến được bằng lối ra tây nam I-59/I-20 tại nút giao thông lập thể trong thành phố Birmingham. Công ty Kia Motors hiện đang xây dựng một nhà máy nằm khoảng ít hơn một giờ đồng hồ lái xe từ xa lộ trên ranh giới hai tiểu bang Alabama–Georgia.
Gần ranh giới phía bắc của tiểu bang Alabama với Tennessee trên I-65, chiều đi về phía nam, là khu dừng xe và Trung tâm Chào mừng của Alabama. Điểm đặc biệt có một không hai của khu dừng xe này so với những khu dừng xe khác là có sự hiện diện của một tên lửa Saturn IB to lớn ở đây như là vật tưởng niệm ghi công sự đóng góp của tiểu bang Alabama nói chung và thành phố Huntsville nói riêng đối với cuộc thám hiểm không gian của NASA.
Tennessee
Xa lộ Liên tiểu bang 65, chiều đi hướng nam tại Nashville.
Xa lộ Liên tiểu bang 65 vào tiểu bang khoảng 5 dặm (8 km) về phía nam của Franklin. Nó đi qua các thành phố lớn Bowling Green, Elizabethtown, và Louisville trước khi ra khỏi tiểu bang.
Có một lúc, đoạn đường của I-65 từ Louisville đến Elizabethtown từng là đường thu phí mang tên Xa lộ thu phí Kentucky. Tiền công trái để tài trợ xây xa lộ đã được trả hết nên đoạn này không còn thu phí nữa. Tất cả các biển hướng dẫn của xa lộ thu phí bị dẹp bỏ.
Ngày 15 tháng 11 năm 2006, đoạn đường của I-65 từ Bowling Green đến Louisville được đặt tên lại là Xa lộ Tưởng niệm Abraham Lincoln.
Ngày 15 tháng 7 năm 2007, các quan chức xa lộ Kentucky nâng tốc độ giới hạn trên các xa lộ liên tiểu bang và xa lộ công viên tiểu bang lên 70 dặm Anh trên giờ (110 km/h). Cho đến thời điểm đó, tiểu bang Kentucky là tiểu bang duy nhất nằm dọc theo đường của I-65 đi qua có tốc độ giới hạn là 65 mph (105 km/h).
Cả hai nhà máy sản xuất xe tải của công ty xe hơi Ford nằm trong Louisville đều có thể đến bằng I-65. Nhà máy sản xuất kiểu xe Explorer SUV có lối thông trực tiếp từ I-65 trong khi nhà máy xe tải Kentucky có thể đến được I-65 qua ngã I-265.
Ngay khi băng vào Quận Lake trên Sông Kankakee, xa lộ có tên là Xa lộ Tưởng niệm Casimir Pulaski cho đến điểm đầu phía bắc của nó.
Trước năm 2004, điểm đầu phía bắc của Xa lộ Liên tiểu bang 65 chỉ cách Xa lộ Liên tiểu bang 90 (Xa lộ thu phí Indiana) khoảng 1/8 dặm (0.2 km) về phía bắc. Cho đến lúc đó, xe cộ đi từ Xa lộ Liên tiểu bang 90 đến Xa lộ Liên tiểu bang 65 phải quẹo trái vào Xa lộ Liên tiểu bang 65 nhờ đèn tín hiệu giao thông. Xe cộ từ Xa lộ Liên tiểu bang 65 đến Xa lộ Liên tiểu bang 90 tránh được đèn tín hiệu nhờ một làn quẹo phải cách biệt. Hiện nay, có một nút giao thông lập thể đơn độc giữa I-65, I-90, US-12, và US-20, vì thế đoạn đứt quãng tại đây đã bị loại bỏ.
Xa lộ Liên tiểu bang 22 tương lai nằm gần thành phố Birmingham sẽ nhập và băng ngang bên dưới I-65 trước khi kết thúc tại Quốc lộ Hoa Kỳ 31 cách đó chừng vài dãy phố. Ngày dự định hoàn thành các đoạn cuối cùng của xa lộ mới là năm 2014. Xa lộ được bắt đầu xây dựng vào ngày 1 tháng 8 năm 2010.
Louisville, Kentucky - I-265 (Xa lộ vành đai ngoài của thành phố Louisville; cũng còn được gọi là Xa lộ cao tốc Gene Snyder; trước đây có tên là Xa lộ cao tốc Jefferson)
New Albany, Indiana - I-265 (dần dần sẽ được kết nối bằng cầu để đến phần phía tiểu bang Kentucky của I-265)
