Diecezja została powołana bullą papieża Piusa VI20 września1785 na terytoriach należących wcześniej do archidiecezji praskiej. Ustanowienia osobnej diecezji dla południowych Czech chciał Józef II Habsburg. Pierwszy biskup Jan Prokop Schaffgotsche (1785-1813) w 1803 otworzył seminarium duchowne, w którym uczono czeskiego. Znajomość tego języka była warunkiem otrzymania święceń. Tym samym biskup wypierał kulturę i język niemiecki z Czech.
Jednym z najwybitniejszych czeskich biskupów był czwarty biskup Czeskich Budziejowic Jan Valerián Jirsík. Dbał o swoją diecezje. Każdą parafie w swoim biskupstwie odwiedził przynajmniej trzy razy. Znany jest z promowania idei utworzenia pełnego czeskojęzycznego szkolnictwa. Doprowadził do powstania do dziś istniejącej szkoły, która obecnie nazywa się Gimnazjum Jana Waleriana Jirsíka. Naraził się tym samym budziejowickim Niemcom. Ta nienawiść trwała aż do II wojny światowej. Jedną z pierwszych rzeczy, które Niemcy zrobili po zajęciu Czeskich Budziejowic była rozbiórka pomników biskupa i zmiana nazwy szkoły nazwanej jego imieniem.
Ósmy biskup Šimon Bárta został mianowany w 1920. Była to pierwsza nominacja biskupa budziejowickiego dokonana wyłącznie przez papieża (do tej pory jedynie zatwierdzał on kandydatów wyznaczonych przez monarchę).
Po śmierci bp. Bárty w 1940 na nowego biskupa został wybrany Czech Antonín Eltschkner. Spotkało się to z ostrą reakcją władz hitlerowskiego Protektoratu Czech i Moraw, które chciały powołania biskupa obywatelstwa niemieckiego. Stolica Apostolska w końcu zdecydowała się nie publikować mianowania Eltschknera, ponieważ było jasne, że nie będzie mógł objąć biskupstwa, lecz także nie powołała innego kandydata. Wakat na tym stanowisku trwał do 1947.
25 czerwca1947Joseph Hlouch został nominowany na biskupa budziejowickiego. Zastał on diecezje w fatalnej sytuacji spowodowanej z jednej strony wyniszczeniem ludności przez hitlerowców, a z drugiej strony obecną sytuacją po dojściu do władzy komunistów. Rozkradali oni majątki kościelne, likwidowali kościelną prasę i szkoły. Księża byli więzieni i zastraszani, w tym biskup Hloucha, który w latach 1950–1968 miał uniemożliwiane przez organy państwowe możliwości sprawowania urzędu. M.in. w latach 1950–1963 został bezprawnie internowany. Po jego śmierci w 1972 roku reżim komunistyczny aż do swojego upadku uniemożliwiał mianowanie nowego biskupa (następca Hloucha mianowany został dopiero w 1990).
