Myklebust var frå Stryn, der faren var skreddar og felespelar.
Rolf tok utdanning ved Musikkonservatoriet i Oslo, og hos konsertmester Gustav Fredrik Lange. Han debuterte i 1931 og gav i åra etter konsertar kring om i landet. Myklebust var lærar i felespel på Musikkonservatoriet frå 1935 til 1952. Han var 1. fiolinist i Oslo-Filharmonien frå 1940 til 1952 da han måtte gje opp musikarkarrièren grunna ein skade i venstrehanda. Myklebust leia sitt eige orkester frå 1945 til langt ut på femtitalet. Rolf Myklebusts ensemble og Turdansensemblet spela òg inn grammofonplater med turdansar. Verksemda vart ført vidare i mellom anna Kai Angel Næsteby s ensemble.
Myklebust vart i 1952 tilsett som programsekretær i Norsk Rikskringkasting NRK, med ansvar for folkemusikken. Denne avdelinga leia han fram til 1978, og samla i desse år inn over tretti tusen lydopptak. Alle åra leia han programposten Folkemusikkhalvtimen.