Ha frequentato la Bishop Kelly High School a Boise, Idaho e la Idaho State University, dove era entrato per una borsa di studio sportiva e dove ha scoperto quasi per caso il suo amore per la recitazione. Dopo la laurea si è recato in Spagna per uno studio sulla recitazione di Shakespeare. Dopo il suo ritorno negli USA nel 1980 la sua carriera inizia con il teatro, recitando allo Steppenwolf Theater di Chicago e fondando la Remains Theater Ensemble.
L'anno successivo è l'anno dell'incontro con il cinema e del debutto a Broadway. L'esordio al cinema con il film del 1981Strade violente diretto da Michael Mann fece subito vedere la sua bravura in film basati su storie di crimine, che nel corso degli anni gli servirà per alcuni dei suoi più importanti lavori. Un altro film di buon successo interpretato da Petersen è Vivere e morire a Los Angeles, girato nel 1985, in cui interpreta un agente federale il cui scopo è dare la caccia ad un falsario che ha fatto uccidere il collega e amico. In questo film va inoltre rilevato il debutto cinematografico di John Turturro, allora ventottenne. Tra le parti che rifiutò, quella di Henry Hill in Quei bravi ragazzi andata poi a Ray Liotta.
Quando Mann lo chiama per il thriller Manhunter - Frammenti di un omicidio, il film dove compare al cinema per la prima volta il personaggio di Hannibal Lecter, per Petersen è una grande occasione per dimostrare la sua validità come attore. Manhunter sarà un flop al box office ma con gli anni diventerà un cult movie del cinema thriller. La sua carriera cinematografica prosegue con diversi film di cui alcuni di discreto successo come Young Guns II - La leggenda di Billy the Kid (1990), Paura (1996), The Skulls - I teschi (2000) ma senza ottenere una grande notorietà fino a quando nel 2000 diventa il protagonista della serie TV CSI - Scena del crimine con la quale nel ruolo di Gil Grissom, entomologo forense, raggiunge una notevole considerazione da parte del pubblico. Dopo aver abbandonato la serie a metà della nona stagione, tornerà nei panni di Grissom nel film TV che chiuderà la serie dopo 15 stagioni.
Il 3 febbraio del 2009, Petersen è stato onorato con una stella sulla Hollywood Walk of Fame. La maggior parte del cast e la troupe di CSI - Scena del crimine ha partecipato alla cerimonia. La sua stella si trova a 6667 Hollywood Blvd.
Vita privata
È stato sposato dal 1974 al 1981 con Joanne Brady, con la quale ha una figlia, nata nel 1975. Il 14 giugno 2003 a Petrognano (Lucca), ha sposato Gina Cirone, insegnante di biologia, con la quale ha avuto due gemelli (un maschio e una femmina) nati nel luglio del 2011 da madre surrogata. Ha due nipoti, nati nel 2003 e nel 2009. Possiede inoltre una compagnia di produzione, la High Horse.
Durante la produzione di CSI - Scena del crimine è stato l'attore televisivo più pagato, con un compenso di 600.000 dollari a puntata. Il secondo posto era detenuto da Kiefer Sutherland che invece incassava 550.000 dollari a puntata.
