מספר חברי הכנסת החברים בקואליציה שהרכיבה את הממשלה הוא הגדול ביותר בהיסטוריה של ישראל - בתקופת ההמתנה לפני מלחמת ששת הימים (מאי 67) הצטרפו מפלגות לקואליציה והיא מנתה מאז ועד סיום כהונתה 111 חברי כנסת. רק מק"י, העולם הזה - כוח חדש, רק"ח ואגודת ישראל לא היו חלק ממנה.
אשכול התקשה להרכיב ממשלה. בעיות עם השותפות מבחוץ, ובעיות במינוי השרים בתוך מפא"י העיבו על התהליך. לכאורה, היה אשכול בשיא עוצמתו לאחר הבחירות. למעשה סימנו בחירות אלה תחילתו של תהליך שחיקה בכוחו ובשליטתו בדעת הקהל.
למשבר קדמו חודשים של חיכוכים עם סוריה, שהביאו לפגיעות ביישובי הצפון, ולקרב אווירי, באפריל 1967, שבו הופלו שישה מטוסי מיג 21 סוריים. נראה כי החלטתו של נאצר להזרים את הכוחות הייתה צעד שנועד להניא את ישראל מהתערבות וניסיון להפיל את המשטר הסורי, צעד שעליו רמז הרמטכ"ל רבין. רבים מעריכים כי המשבר החל מבלי שתהייה כוונה אצל איש מן הצדדים להביא למלחמה כוללת, אך שורה של צעדים שלא ניתן היה לחזותם מראש, הביאו את האזור אל המלחמה.
עם כניסת הכוחות המצריים לסיני הורה מזכ"ל האו"ם, או תאנט, על פינוי כוחות האו"ם שהיו בסיני, וזאת לאחר דרישתו של נאצר כי יפנה את הכוחות באופן חלקי. פעולה זו הביאה לכך שנאצר ישלוט במצרי טיראן, דבר שהביא למצור ימי על מדינת ישראל. בתוך יומיים, מ-19 במאי ואילך, גויס כוח המילואים של מדינת ישראל והועמד בכוננות. החלה תקופת המתנה, במהלכה שותק המשק הישראלי עקב שהיית כל הגברים הכשירים בשירות מילואים, וחרדה קיומית ירדה על המדינה.
הציבור הישראלי לא חש ביטחון באשכול. ככל שהתמשכה תקופת ההמתנה, ואשכול לא הורה על יציאה למלחמה, גבר החשש כי מדינות ערב יקדימו את מדינת ישראל ויפתחו ראשונות במתקפה.
ב-1 ביוני מסר אשכול את תיק הביטחון לידיו של משה דיין. כן צורפו לממשלה החדשה שהוקמה נציגי גח"למנחם בגין ויוסף ספיר, כשרים בלי תיק. הייתה זו ממשלת האחדות הראשונה שהוקמה במדינת ישראל, ובאותו הזמן כונתה "ממשלת ליכוד לאומי". עם מינויו של דיין לשר הביטחון, איבד אשכול את ההנהגה, ולמעשה מסר בידיו של דיין את ההכרעה על היציאה למלחמה ועל מהלכה.
המלחמה, לכשפרצה, הייתה הניצחון הצבאי הגדול ביותר שלו זכתה מדינת ישראל מאז ומעולם. תוך שישה ימים הביס צה"ל את צבאות ערב, כבש את חצי האי סיני, את יהודה ושומרון, את רצועת עזה ואת רמת הגולן. ירושלים אוחדה, ונכבש הכותל המערבי.
סיום כהונת הממשלה
לאחר המלחמה נחלש אשכול הן מהבחינה האישית והן מהבחינה הבריאותית. מחלת הסרטן הכתה בו, והוא הלך ואיבד את כושרו להמשיך בחיים הפוליטיים. בסוף שנת 1968 היה ברור כי אשכול לא יאריך ימים. עוד בימי חייו סוכם בין ראשי מפלגת העבודה כי יורשתו תהיה גולדה מאיר[דרוש מקור]. ב-3 בפברואר1969 לקה אשכול בהתקף לב, אך לאחר שנמסר כי החלים ממנו ושב לעבודה, לקה בהתקף נוסף, וב-26 בפברואר1969 נפטר והממשלה סיימה את כהונתה. יגאל אלון מילא את מקומו במשך 19 יום כראש ממשלה בפועל, עד אשר מאיר הקימה ממשלה ב-17 במרץ.