A transfección é o proceso de introducir de forma deliberada ácidos nucleicos espidos ou purificados en células eucariotas.[1][2] Tamén se pode referir a outros métodos e tipos celulares, aínda que adoitan preferirse neses casos outros termos, como transformación ou transdución. "Transformación" é o termo usado para descrbir a transferencia de ADN non viral en bacterias e células eucariotas non animais, incluíndo as células de plantas. En células animais transfección é o termo preferido, xa que transformación tamén se usa para referirse á progresión a un estado canceroso (carcinoxénese) nestas células. O termo transdución adoita utilizarse para describir a transferencia de xenes mediada por virus en células.[2][3]
A transfección de células animais implica tipicamente a abertura de poros transitorios ou "buratos" na membrana plasmática polos que se pode realizar a captación do material. A transfección pode levarse a cabo usando fosfato de calcio (concretamente, fosfato tricálcico), por electroporación, por deformación da célula para que pase a presión por un estreito burato (cell squeezing) ou pola mestura dun lípidocatiónico co material para producir liposomas que se fusionan coa membrana celular e depositan o seu cargamento no interior.
A transfección pode orixinar morfoloxías inesperadas e anormalidades nas células diana.
Terminoloxía
O significado do termo foi evolucionando.[4] O significado orixinal de transfección era "infección por transformación", é dicir, introdución nas células de material xenético, ADN ou ARN, dun virus que infecta a un procariota ou bacteriófago, rcomo resultado dunha infección. Como o termo transformación tiña outro senso en bioloxía das células animais (un cambio xenético que permite a propagación a longo prazo en cultivo ou a adquisición de propiedades típcias das células cancerosas), o termo transfección adquiriu, para células animais, o seu significado actual de cambio nas propiedades causado pola introdución dun ADN.
Métodos
Hai varios métodos para introducir ADN alleo nunha célula eucariota. Algúns dependen dun tratamento físico (electroporación, introducir células a presión (cell squeezing), nanopartículas, magnetofección); outros dependen de materiais químicos ou partículas biolóxicas (virus) que se utilizan como transportadores. A entrega de xenes é, por exemplo, un dos pasos necesarios para realizar unha terapia xénica e a modificación xenética de plantas de cultivo agrícola. Desenvolvéronse varios métodos de entrega de xenes para varios tipos de células e tecidos, desde bacterias a mamíferos. Xeralmente, os métodos poden dividirse en dúas categorías: non viral e viral.[5]
A entrega de xenes mediada por virus utiliza a capacidade que teñen certos virus de inxectar o seu ADN na célula hóspede. Un xene que se quere entregar á célula empaquétase nunha partícula viral que é deficiente para a súa replicación. Os virus usados ata agora foron retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados e virus herpes simplex. Porén, existen inconvenientes para o uso de virus para entregar xenes nas células: os virus poden entregar só fragmentos moi pequenos de ADN ás células, o proceso require moito traballo e hai un risco por sitios de inserción aleatoria, efectos citopáticos e mutaxénese.
Métodos non virais
Transfección baseada en compostos químicos
A transfección baseada en compostos químicos pode ser dividida en varios tipos: ciclodextrina,[7]polímeros,[8] liposomas ou nanopartículas[9] (con ou sen funcionalización viral ou química. Véxase máis adiante).
Un dos métodos máis baratos usa o fosfato de calcio, e foi descuberto orixinalmente por F. L. Graham e A. J. van der Eb en 1973[10] (ver tamén[11]). Unha solución salina tamponada con HEPES (HeBS) que contén ións fosfato combínase cunha solución de cloruro de calcio que contén o ADN que vai ser transfectado. Cando se combinan os dous, fórmase un fino precipitado do calcio cargado positivamente e o fosfato cargado negativamente, que une sobre a súa superficie o ADN que vai ser transfectado. Despois, a suspensión do precipitado engádese ás células que van ser transfectadas (xeralmente un cultivo celular en monocapa). Por un proceso que non se comprende enteiramente, as células captan parte do precipitado, e con el, o ADN. Este proceso foi un método preferido para identificar moitos oncoxenes.[12]
Outros métodos usan compostos orgánicos altamente ramificados, denominados dendrímeros, para unirse ao ADN e entrar na célula.
A lipofección (ou transfección por liposomas) é unha técnica usada para inxectar material xenético nunha célula por medio de liposomas, que son vesículas que poden doadamente fusionarse coa membrana plasmática, xa que ambos están feitos dunha bicapa fosfolipídica.[13] A lipofección usa xeralmente un lípido cargado positivamente (liposomas catiónicos ou mesturas) para formar un agregado co material xenético cargado negativamente.[14] Esta tecnoloxía de transfección realiza as mesmas tarefas que outros procedementos bioquímicos que utilizan polímeros, DEAE-dextrano, fosfato de calcio e a electroporación. A eficiencia da lipofección pode ser mellorada tratando as células transfectadas cun suave shock térmico.[15]
Un fuxene é unha serie de reactivos de transcrición non liposómicos comerciais amplamente usados con capacidade de transfectar directamente unha ampla variedade de células con alta eficiencia e baixa toxicidade.[16][17][18][19]
Métodos non químicos
Electroporación (electrotransferencia de xenes) é un método popular, no que o incremento transitorio da permeabilidade da membrana plasmática conséguese expoñendo as células a pulsos curtos dun campo eléctrico intenso.
O CellSqueeze usa un método inventado en 2012 por Armon Sharei, Robert Langer e Klavs Jensen no MIT. Permite a entrega de moléculas ás células por medio da deformación da membrana plasmática. É unha plataforma microfluídica libre de vectores de alto rendemento para a entrega intracelular. Reduce a posibilidade de toxicidade ou efectos fóra da diana, xa que non depende de materiais exóxenos nin de campos eléctricos.[20]
A sonoporación usa un ultrasón de alta intensidade para inducir a formación de poros na membrana plasmática. Esta formación de poros é atribuída principalmente á cavitación de burbullas de gas que interaccionan coas membranas celulares próximas, xa que é potenciada pola adición dun axente de contraste de ultrasóns, unha fonte de núcleos de cavitación.
A transfección óptica é un método no que se xera transitoriamente un diminuto burato (de ~1 µm de diámetro) na membrana plasmática dunha célula usando un láser moi enfocado. Esta técnica foi descrita primeiro en 1984 por Tsukakoshi et al., que usou unha frecuencia Nd:YAG triplicada para xerar transfeccións estables e transitorias en células de ril de ratas normais.[21] Nesta técnica trátase unha soa célula de cada vez, o que a fai particularmente útil para análises dunha soa célula.
A fusión de protoplastos é unha técnica na cal as células transfectadas transformadas son tratadas con lisozima para eliminar a parede celular. Despois, utilízanse axentes fusoxénicos (por exemplo, o virus Sendai, PEG, electroporación) para fusionar o protoplasto que transporta o xene de interese coa célula receptora diana. Unha importante desvantaxe deste método é que os compoñentes bacterianos non son introducidos especificamtente na célula diana.
A empalafección (impalefection) é un método consistente en introducir ADN unido á superficie dunha nanofibra que é inserida na célula (que queda "empalada"). Esta estratexia pode tamén realizarse con matrices de nanofibras que se introducen en gran cantidade de células e tecidos intactos.
A entrega hidrodinámica é un método usado en ratos e ratas, pero en menor extensión tamén en animais meirandes, na cal o ADN normalmente en plásmidos (incluíndo os transposóns) pode ser entregado no fígado usando unha inxección hidrodinámica que implica a infusión dun volume relativamente grande de sangue en menos de 10 segundos. Por este procedemento case todo o DNA se expresa no fígado.[22][23][24]
Métodos baseados en partículas
Entre eles están os seguintes (algúns xa mencionados antes):
Unha estratexia directa para a transfección é a escopeta de xenes (gene gun), na que o ADN está acoplado a unha nanopartícula dun sólido inerte (normalmente ouro), que é despois "disparado" directamente contra o núcleo da célula diana.
A magnetofección ou transfección axudada con imán, é un método de transfección que usa a forza magnética para entregar ADN nas células diana. Os ácidos nucleicos son primeiro asociados con nanopartíclas magnéticas. Despois, a aplicación de forza magnética impulsa os complexos de partículas de ácidos nucleicos cara a e ao interior das células diana, nas que se libera o cargamento.[25]
A empalafección é levada a cabo por células empaladas por nanoestruturas alongadas e matrices de tales nanoestruturas como as nanofibras de carbono ou nanocables de silicio que foron funcionalizadas con ADN de plásmidos.
Outro método de transfección baseado en partículas coñécese como bombardeo de partículas. O ácido nucleico é entregado por penetración nas membranas a unha alta velocidade, xeralmente conectado a microproxectís.[2]
O ADN pode tamén ser introducido nas células usando virus como transportadores. En tales casos, a técnica denomínase transdución viral, e as células dise que son transducidas. Os vectores adenovirais poden ser útiles para os métodos de transfección viral porque poden transferir xenes nunha ampla variedade de células humanas e teñen altas taxas de transferencia.[2] Os vectores lentivirais son tamén útiles debido á súa capacidade de transducir células que non están nese momento experimentando mitose.
Transfeccións estables e transitorias
A transfección estable e transitoria diferéncianse nos seus efectos a longo prazo sobre a célula. Unha célula transfectada establemente expresa de forma continua o ADN transfectado e transmíteo ás células fillas durantre a división celular, mentres que unha célula transfectada transitoriamente expresa o ADN transfectado durante un curto período de tempo e non o transmite ás súas células fillas.
Para algunhas aplicacións da transfección abonda con que o material xenético transfectado se exprese só de forma transitoria. Como o ADN introducido no proceso de transfección xeralmente non está integrado no xenoma nuclear, o ADN alleo será diluído durante a mitose ou degradado.[27] As liñas celulares que expresan o antíxeno 1 do virus de Epstein–Barr (EBNA1) ou o antíxeno T grande de SV40, permiten a amplificación episómica de plásmidos que contiñan as orixes de replicación virais do virus de Epstein-Barr (293E) ou de SV40 (293T), reducindo grandemente a taxa de dilución.[28]
Se se desexa que o xene transfectado permaneza realmente no xenoma da célula e as súas células fillas, debe producirse unha transfección estable. Para realizar isto, cotransféctase un xene marcador, que lle dá á célula algunhas vantaxes selectivas, como a resistencia a certas toxinas. Algunhas (moi poucas) das células transfectadas terán integrado, por casualidade, o material xenético alleo nos seus xenomas. Se a toxina é despois engadida ao cultivo cellar, só unhas poucas células que tiñan o xene marcador integrado nos seus xenomas poderán proliferar, mentres que as outras células morrerán. Despois de aplicar este estrés selectivo (presión de selección) durante certo tempo, soamente as células cunha transfección estable permanecerán e poderán seguir sendo cultivadas.[29]
Axentes comúns para seleccionar unha transfección estable son:
Xeneticina, ou G418, neutralizada polo produto do xene de resistencia á neomicina.
O ARN pode ser tamén transfectado ao interior de células para que se exprese transitoriamente a proteína que codifica, ou para estudar a cinética da degradación do ARN. A transfección de ARN é a miúdo usada nas células primarias que non se dividen.
Os ARN interferentes pequenos poden tamén ser transfectados para conseguir o silenciamento de ARN (é dicir, a perda do ARN e as proteínas do xene obxectivo). Esta converteuse nunha aplicación principal en investigación para conseguir o "knock-down" de proteínas de interese (por exemplo, a endotelina-1[30]) con aplicacións potenciais en terapia xénica. As limitacións da estratexia de silenciamento son a toxicidade da transfección para as células e os posibles efectos "fóra de diana" sobre a expresión doutros xenes/proteínas.
↑ 2,02,12,22,3"Transfection". Protocols and Applications Guide. Promega. Arquivado dende o orixinal o 25 de xuño de 2014. Consultado o 22 de decembro de 2018.
↑Menuel S, Fontanay S, Clarot I, Duval RE, Diez L, Marsura A (December 2008). "Synthesis and complexation ability of a novel bis- (guanidinium)-tetrakis-(beta-cyclodextrin) dendrimeric tetrapod as a potential gene delivery (DNA and siRNA) system. Study of cellular siRNA transfection". Bioconjugate Chemistry19 (12): 2357–62. PMID19053312. doi:10.1021/bc800193p.
↑Fischer D, von Harpe A, Kunath K, Petersen H, Li Y, Kissel T (2002). "Copolymers of ethylene imine and N-(2-hydroxyethyl)-ethylene imine as tools to study effects of polymer structure on physicochemical and biological properties of DNA complexes". Bioconjugate Chemistry13 (5): 1124–33. PMID12236795. doi:10.1021/bc025550w.
↑Graham FL, van der Eb AJ (April 1973). "A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA". Virology52 (2): 456–67. PMID4705382. doi:10.1016/0042-6822(73)90341-3.
↑Jacobsen LB, Calvin SA, Colvin KE, Wright M (June 2004). "FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power". Methods. Transfection of Mammalian Cells 33 (2): 104–12. PMID15121164. doi:10.1016/j.ymeth.2003.11.002.
↑Hellgren I, Drvota V, Pieper R, Enoksson S, Blomberg P, Islam KB, Sylvén C (August 2000). "Highly efficient cell-mediated gene transfer using non-viral vectors and FuGene6: in vitro and in vivo studies". Cellular and Molecular Life Sciences(en inglés)57 (8–9): 1326–33. PMID11028922. doi:10.1007/PL00000769.
↑Tsukakoshi M, Kurata S, Nomiya Y, et al. (1984). "A Novel Method of DNA Transfection by Laser Microbeam Cell Surgery". Applied Physics B: Photophysics and Laser Chemistry35 (3): 135–140. Bibcode:1984ApPhB..35..135T. doi:10.1007/BF00697702.
↑Zhang G, Budker V, Wolff JA (July 1999). "High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA". Human Gene Therapy10 (10): 1735–7. PMID10428218. doi:10.1089/10430349950017734.
↑Zhang G, Vargo D, Budker V, Armstrong N, Knechtle S, Wolff JA (October 1997). "Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers". Human Gene Therapy8 (15): 1763–72. PMID9358026. doi:10.1089/hum.1997.8.15-1763.
↑Schnoor M, Buers I, Sietmann A, Brodde MF, Hofnagel O, Robenek H, Lorkowski S (May 2009). "Efficient non-viral transfection of THP-1 cells". Journal of Immunological Methods344 (2): 109–15. PMID19345690. doi:10.1016/j.jim.2009.03.014.
Giorgi IIIგიორგი IIIRaja dari raja-raja Georgia (more)Giorgi III (fresko di Biara KintsvisiRaja Georgia ke-8Berkuasa1156–1184PendahuluDemetrius IPenerusTamarInformasi pribadiKematian27 Maret 1184PemakamanBiara GelatiDynastyBagrationiAyahDemetrius I dari GeorgiaPasanganBurdukhani dari AlaniaAnakTamarRusudaniAgamaOrtodoks Georgia Giorgi III (bahasa Georgia: გიორგი III) (†27 Maret 1184), dari Wangsa Bagrationi, merupakan seorang Raja Georgia dari tahun 1156 hingga...
Tomáš Rosický Rosický con el Arsenal en 2007Datos personalesApodo(s) El pequeño Mozart, El hijo de ChukyNacimiento Praga4 de octubre de 1980 (43 años)País República ChecaNacionalidad(es) Checa ChecaAltura 1,78 m (5′ 10″)Peso 68 kg (150 lb)Carrera deportivaDeporte FútbolClub profesionalDebut deportivo 1998(Sparta Praga)Posición CentrocampistaGoles en clubes 64Retirada deportiva 2017(Sparta Praga)Selección nacionalSelección CZE República ChecaDebut 23 d...
Map showing Fort Maurepas and Bas de la Rivière on the Winnipeg River. Bas de la Rivière is a geographical area on both sides of the Winnipeg River at and near the mouth where it empties into Lake Winnipeg. It had a storied historical period in the opening of the west and the subsequent fur trade and settlement. It is known that Jean Baptiste de La Vérendrye, Pierre Gaultier de La Vérendrye and their men, explored the area in 1733 and built Fort Maurepas on the Red River in 1734. They may...
The cover of Slavery, sugar and the culture of refinement: Picturing the British West Indies, 1700-1840 (2008) Kay Dian Kriz (born 1945) is professor emerita of art and architecture at Brown University. She is a specialist in British landscape painting and the visual culture of British colonialism and West Indian slavery. Early life Kay Dian Kriz was born in 1945. She received her BS from Indiana University in 1966, her BA from Western Washington University in 1981 and her MA and PhD from the...
لمعانٍ أخرى، طالع جون ستيفنسون (توضيح). هذه مقالة غير مراجعة. ينبغي أن يزال هذا القالب بعد أن يراجعها محرر مغاير للذي أنشأها؛ إذا لزم الأمر فيجب أن توسم المقالة بقوالب الصيانة المناسبة. يمكن أيضاً تقديم طلب لمراجعة المقالة في الصفحة المخصصة لذلك. (يوليو 2020) جون ستيفنسو...
This article relies excessively on references to primary sources. Please improve this article by adding secondary or tertiary sources. Find sources: Hindustan Newsprint – news · newspapers · books · scholar · JSTOR (September 2019) (Learn how and when to remove this template message) Hindustan Newsprint Ltd. (HNL) was a government company in the Indian Central Public Sector. HNL was incorporated under the Companies Act, 1956, on 7 June 1983, in Kottaya...
Odby Bay at Thyholm, close to Oddesund Thyholm Peninsula is a peninsula in Denmark located in Limfjorden north of Struer. It is connected by causeway with North Jutlandic Island and the rest of Thy. To the south, the Oddesund Bridge connects it to the rest of Jutland. With an area of 7,624 ha, the peninsula has some 75 km of coastline and 3,582 inhabitants, of whom about half live in Hvidbjerg. The fertile soil has attracted inhabitants since the last ice age. Burial mounds can be seen in the...
1995 single by Jeff FoxworthyRedneck 12 Days of ChristmasSingle by Jeff Foxworthyfrom the album Crank It Up: The Music Album B-side'Twas the Night After Christmas[1]ReleasedDecember 1995GenreComedy, countryLength2:21LabelWarner Bros. RecordsSongwriter(s)Jeff FoxworthyTim WilsonProducer(s)Doug GrauScott RouseJeff Foxworthy singles chronology Party All Night (1995) Redneck 12 Days of Christmas (1995) Redneck Games (1996) Redneck 12 Days of Christmas is a redneck parody of The Twelve Day...
American actress (born 1964) Mariska HargitayHargitay in 2011BornMariska Magdolna Hargitay (1964-01-23) January 23, 1964 (age 59)Santa Monica, California, U.S.Alma materUniversity of California, Los AngelesOccupationsActressdirectorproducerphilanthropistYears activesince 1984Spouse Peter Hermann (m. 2004)Children3[a]ParentsMickey Hargitay (father)Jayne Mansfield (mother)RelativesJayne Marie Mansfield (half-sister)AwardsPrimetime Emmy Award...
2008 South Korean filmGo Go 70sKorean nameHangul고고70Revised RomanizationGogo 70McCune–ReischauerKogo 70 Directed byChoi HoWritten byChoi Ho Bang Jun-seok Baek Bae-jeongProduced byShim Bo-kyeong Lee Jong-ho Park Jae-hyunStarringCho Seung-woo Shin MinaCinematographyKim Byeong-seoEdited byKim Sang-bum Kim Jae-bumMusic byBang Jun-seokDistributed byShowbox/MediaplexRelease date October 2, 2008 (2008-10-02) Running time118 minutesCountrySouth KoreaLanguageKoreanBox office(admis...
Category 1 Atlantic hurricane in 2008 Hurricane Hanna Hanna at peak intensity over the Turks and Caicos Islands on September 1Meteorological historyFormedAugust 28, 2008ExtratropicalSeptember 7, 2008DissipatedSeptember 12, 2008Category 1 hurricane1-minute sustained (SSHWS/NWS)Highest winds85 mph (140 km/h)Lowest pressure977 mbar (hPa); 28.85 inHgOverall effectsFatalities~537 totalDamage$160 million (2008 USD)Areas affectedPuerto Rico, Turks and Caicos Islands, Ba...
رعو (بالعبرية: רעו) معلومات شخصية الميلاد سنة 1974 ق م[1] أور تاريخ الوفاة سنة 1735 ق م[2] الأولاد ساروغ[3] الأب فالخ[4] تعديل مصدري - تعديل رعو بن فالج [5] (بالعبرية: רְעוּ) هو شخصية توراتية مذكورة في العهد القديم في سفر التكوين، وهو أبو...
This article may be confusing or unclear to readers. Please help clarify the article. There might be a discussion about this on the talk page. (February 2009) (Learn how and when to remove this template message) Intermaxillary segmentDiagram showing the regions of the adult face and neck related to the fronto-nasal process and the branchial arches. (Globular processes labeled at center right.)DetailsPrecursormedial nasal prominence[1]Gives rise toprimary palate[2]Anatomical te...
Former Czech political position Staré purkrabství in Prague Castle The Supreme Burgrave of the Kingdom of Bohemia, originally the Burgrave of Prague or the Burgrave of Prague Castle (Czech: Nejvyšší purkrabí; German: Oberstburggraf; Latin: supremus burgravius) was the most important land official of the Kingdom of Bohemia. They were the head of the Bohemian Diet and the Bohemian land court [cs], and commander of the Zemská hotovost [cs]. The supreme burgrave w...
Questa voce sull'argomento cestisti statunitensi è solo un abbozzo. Contribuisci a migliorarla secondo le convenzioni di Wikipedia. Segui i suggerimenti del progetto di riferimento. Markus Howard Nazionalità Stati Uniti Altezza 178 cm Peso 79 kg Pallacanestro Ruolo Playmaker Squadra Saski Baskonia Carriera Giovanili Perry High SchoolFindlay Prep2016-2020 Marquette G. Eagles Squadre di club 2020-2022 Denver Nuggets68 (231)2021-2022→ G. Rapids Gold2 (33)2022...
Indian politician (1939–2020) Narendra Kumar SwainMember of the Rajya SabhaIn office7 December 2015 – 2 April 2020Preceded byTBASucceeded byMunna KhanConstituencyOdisha Personal detailsBorn(1939-06-25)25 June 1939Tandikana, Cuttack district, OdishaDiedSeptember 7, 2020(2020-09-07) (aged 80)Cause of deathhearth attackPolitical partyBiju Janata DalSpouseSuprava SwainChildrenTwo sons and two daughtersResidence(s)Khari Sahi, Tandikana, Cuttack districtEducationB.A., LL...