A fosfofrutoquinase-1[1] ou PFK-1 (ás veces escrita fosfofrutoquinase 1 ou PFK1) ou 6-fosfofrutoquinase con Número EC 2.7.1.11, é un dos encimas regulatorios máis importantes da glicólise. Cataliza a terceira reacción da glicólise, na cal a frutosa 6-fosfato e o ATP se converten en frutosa 1,6-bisfosfato e ADP. A reacción que cataliza é unha fosforilación dependente do ATP, que é un dos pasos limitantes e regulatorios chave da glicólise. É un encima alostérico constituído por catro subunidades e controlado por moitos activadores e inhibidores. A PFK-1 pode regular a glicólise por inhibición alostérica, e deste modo, a célula pode aumentar ou diminuír a velocidade da glicólise en resposta aos requirimentos enerxéticos da célula en cada momento. Por exemplo, unha alta proporción de ATP con respecto ao ADP inhibe a PFK-1 e a glicólise. As diferenzas chave entre a regulación da PFK-1 en eucariotas e procariotas é que nos eucariotas este encima é activado pola frutosa 2,6-bisfosfato. O propósito desta activación por frutosa 2,6-bisfosfato é superar a inhibición por ATP, o que permite aos eucariotas ter unha maior sensibilidade á regulación por hormonas como o glicagón e a insulina.[2]
Reacción
A continuación un esquema da reacción catalizada pola fosfofrutoquinase-1 (a reacción inversa é catalizada pola frutosa 1,6-bisfosfatase ou frutosa bisfosfatase).
Á parte da súa escritura con guión ou sen el (fosfofrutoquinase-1 ou fosfofrutoquinase 1, e aínda fosfofrutoquinase I), que se pode atopar das dúas maneiras na literatura e bases de datos de proteínas (ver a sección sinónimos de BRENDA e outras nas táboas), ás veces á fosfofrutoquinase-1 chámaselle simplemente fosfofrutoquinase en moitos textos, porque é a máis estudada e coñecida, aínda que existe tamén a fosfofrutoquinase-2 e outras fosfofrutoquinases. Outros nomes que recibiu a fosfofrutoquinase-1 son: 6-fosfofrutoquinase (que é o seu nome recomendado), 6-fosfofruto-1-quinase, frutosa-6-fosfato 1-quinase, e frutosa-6-fosfato 1-fosfotransferase, entre outros.[1]
Estrutura
A PFK-1 de mamífero é un tetrámero de 340 kd[3] composto por catro subunidades que poden ser de tres tipos segundo o tecido que se trate: M (típica do músculo), L (do fígado, liver en inglés), e P (das plaquetas e outros tecidos). As subunidades de que consta o tetrámero dependerán do tipo de tecido. No caso do músculo maduro só se expresa o isoencima M, polo que o encima é alí un homotetrámero M4. No fígado e riles exprésase predominantemente a isoforma L. Nos eritrocitos exprésanse tanto as subunidades M coma a L, que se tetramerizan aleatoriamente formando os homotetrámeros M4, L4 e as formas híbridas ML3, M2L2 e M3L. Como resultado, as propiedades cinéticas e regulatorias dos varios isoencimas dependen da súa composición en subunidades. Os cambios específicos de tecido na actividade do encima e no contido de isoencimas contribúen significativamente á diversidade nas taxas de glicólise e gliconeoxénese que se observan en diferentes tecidos.[4]
A PFK-1 é un encima alostérico e ten unha estrutura similar á da hemoglobina no sentido de que é un dímero dun dímero.[5] Unha metade de cada dímero contén o sitio de unión para o ATP mentres que a outra metade ten o sitio de unión para o substrato frutosa 6-fosfato e un sitio adicional para a unión dun regulador alostérico.[6]
Cada subunidade do tetrámero ten 319 aminoácidos e consta de dous dominios, un para a unión do ATP e outro para a unión da frutosa 6-fosfato. Cada dominio é un barril beta, e ten unha lámina beta cilíndrica rodeada de hélices alfa.
En cada subunidade no lado oposto ao centro activo está o centro alostérico, na interface entre as subunidades do dímero. Aquí únese o ADP, que fai de regulador alostérico. O dominio N-terminal ten un papel catalítico e a el únese o ATP, mentres que o C-terminal ten un papel regulatorio.[7]
Mecanismo
A PFK-1 é un encima alostérico cuxa actividade pode describirse utilizando o modelo de simetría do alosterismo,[8] no cal hai unha transición concertada entre un estado T (tenso) encimaticamente inactivo e un estado R (relaxado) activo. A frutosa 6-fosfato únese con grande afinidade ao estado R do encima pero non ao estado T. Por cada molécula de frutosa 6-fosfato que se une á PFK-1, o encima cambia progresivamente do estado T ao R. Deste modo un gráfico da actividade da PFK-1 con concentracións crecentes de frutosa 6-fosfato ten forma de curva sigmoidal, típica dos encimas alostéricos.
A PFK-1 pertence á familia das fosfotransferases e cataliza a transferencia dun fosfato γ (gamma) desde o ATP á frutosa 6-fosfato. O sitio activo da PFK-1 comprende os sitios de unión para o ATP-Mg2+ e para a frutosa 6-fosfato. Algúns dos residuos que se propuxo que están implicados na unión do substrato na PFK-1 de E. coli son o Asp127 e a Arg171.[9] Na PFK-1 de Bacillus stearothermophilus, a cadea lateral cargada positivamente do residuo Arg162 forma unha ponte salina unida ao hidróxeno co grupo fosfato cargado negativamente da frutosa 6-fosfato, unha interacción que estabiliza o estado R en relación co estado T, e que é en parte responsable do efecto homotrópico da unión da frutosa 6-fosfato. No estado T, a conformación do encima cambia lixeiramente de tal modo que o espazo que previamente ocupaba a Arg162 é agora ocupado polo Glu161. Este intercambio de posicións entre residuos de aminoácidos adxacentes inhibe a unión da frutosa 6-fosfato ao encima.
Os activadores alostéricos como o AMP e o ADP únense ao sitio alostérico para facilitar a formación do estado R ao induciren cambios estruturais no encima. De xeito similar, os inhibidores como o ATP e o fosfoenolpiruvato únense ao mesmo sitio alostérico e facilitan a formación do estado T, inhibindo así a actividade do encima.
O oxíxeno do grupo hidroxilo do carbono 1 fai un ataque nucleofílico sobre o fosfato beta do ATP. Os electróns son impulsados ao oxíxeno anhidro que une os fosfatos beta e gamma do ATP.[10][11]
Mecanismo de funcionamento da fosfofrutoquinase-1.
Regulación
A reacción da PFK-1 é o punto de control máis importante na vía glicolítica de mamíferos. Este paso está sometido a unha extensa regulación, xa que non só é moi exergónico en condicións fisiolóxicas, senón que tamén é a primeira reacción irreversible exclusiva da vía glicolítica. Esta regulación permite un control preciso da glicosa e outros monosacáridos como galactosa e frutosa que entran na vía glicolítica. Antes desta reacción encimática, a glicosa 6-fosfato pode potencialmente desviarse á vía da pentosa fosfato, ou ser convertida en glicosa 1-fosfato para ser utilizada na síntese de glicóxeno.
A PFK-1 é inhibida alostericamente por niveis altos de ATP pero o AMP inverte esta acción inhibitoria do ATP. Por tanto, a actividade do encima increméntase cando a proporción ATP/AMP na célula baixa. A glicólise está estimulada cando a carga de enerxía cae. A PFK-1 ten dous sitios con diferentes afinidades para o ATP, que é á vez inhibidor e substrato (xunto coa frutosa 6-fosfato) do encima.[3]
A PFK-1 é tamén inhibida polos pHs baixos (ácidos), os cales aumentan os efectos inhibitorios do ATP. O pH cae, por exemplo, cando os músculos están funcionando anaerobicamente e producindo ácido láctico e moito H+ (este último é o que causa a acidificación). Este efecto inhibitorio serve para protexer ao músculo dos danos que se poderían producir por esta acidez.[3]
Finalmente, a PFK-1 é inhibida alostericamente polo fosfoenolpiruvato (PEP) e probablemente polo citrato. O fosfoenolpiruvato é un produto das reaccións finais da glicólise. Xeralmente considérase que o citrato é outro inhibidor alostérico da PFK-1, pero discútese se in vivo os niveis de citrato son suficientes como para producir esta inhibición, aínda que si o fai coas concentracións dos experimentos in vitro.
A PFK1 é activada alostericamente por unha alta concentración de AMP, pero o seu activador máis potente é a frutosa 2,6-bisfosfato, que se produce tamén a partir da frutosa 6-fosfato por acción do encima fosfofrutoquinase-2. Así que, cando hai abundancia de frutosa 6-fosfato orixínanse maiores concentracións de frutosa 2,6-bisfosfato (F-2,6-BP). A unión ao encima da frutosa 2,6-bisfosfato incrementa a afinidade da PFK-1 pola frutosa 6-fosfato e diminúe o efecto inhibitorio do ATP. Isto é un exemplo de estimulación por feedforward (alimentación cara a adiante) que acelera a glicólise cando a glicosa é abundante.[3]
A PFK-1 é inhibida polo glicagón, que reprime a súa síntese. o glicagón activa a proteína quinase A, a cal, á súa vez, corta a actividade quinase da fosfofrutoquinase-2 (PFK-2). Isto inverte a síntese de frutosa 2,6-bisfosfato a partir de frutosa 6-fosfato e dese modo inhibe a actividade da PFK-1.
A regulación precisa da PFK-1 impide que a glicólise e a gliconeoxénese teñan lugar simultaneamente. Porén, hai un ciclo de substratos (ou ciclo fútil) entre a frutosa 6-fosfato e a frutosa 1,6-bisfosfato. O encima frutosa 1,6-bisfosfatase (FBPase) cataliza a hidrólise da frutosa 1,6-bisfosfato de novo a frutosa 6-fosfato, revertendo a reacción catalizada pola PFK-1. Hai unha pequena cantidade de actividade da FBPase durante a glicólise e algunha actividade da PFK1 durante a gliconeoxénese. Este ciclo permite a amplificación de sinais metabólicos e a xeración de calor por hidrólise de ATP.
A serotonina (5-HT) incrementa a actividade da PFK-1 ao unirse ao receptor 5-HT(2A), causando que un residuo de tirosina da PFK-1 sexa fosforilado pola vía da fosfolipase C. Como a PFK-1 regula o fluxo glicolítico en ratos, a serotonina exerce un papel regulatorio na glicólise.[12]
O principal trastorno causado polo mal funcionamento da PFK-1 é a enfermidade de Tauri. Unha mutación xenética no xene PFKM orixina unha deficiencia de fosfofrutoquinase chamada enfermidade de Tarui, que é unha enfermidade do almacenamento de glicóxeno na que a capacidade de certos tipos de células para utilizar os carbohidratos como fonte de enerxía está alterada.[13]
Enfermidade de Tarui: Os seus síntomas son debilidade muscular (miopatía) e cambras e espasmos inducidos polo exercicio, mioglobinuria (presenza de mioglobina na urina, que indica destrución do tecido muscular) e hemólise compensada. O ATP é un inhibidor da PFK-1, que impide a produción innecesaria de ATP por glicólise, pero a mutación Asp(543)Ala pode orixinar que o ATP teña un efecto inhibitorio moito máis forte (debido a que aumenta a súa unión ao sitio alostérico inhibitorio do encima).[14][15]
Mutacións na PFK-1 e cancro: Para que as células cancerosas obteñan a enerxía que cómpre para o seu rápido crecemento e división, é favorable que teñan un encima PFK-1 hiperactivo. Cando as células cancerosas crecen e se dividen tan rapidamente, inicialmente non teñen un subministración suficiente de sangue, e poden morrer de hipoxia (falta de oxíxeno), e isto activa a O-GlcNAcilación na serina 529 da PFK-1, o que lles dá unha vantaxe para o crecemento selectiva.[16][16][17][18]
As infeccións víricas e a PFK-1: Algúns virus, como o VIH, HCMV, Mayaro, e HCMV afectan a vías metabólicas celulares como a glicólise por un incremento dependente de MOI na actividade da PFK-1. O Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) tamén afecta á PFK-1. O mecanismo por medio do que o Herpesvirus incrementa a actividade da PFK-1 é a fosforilación do encima en residuos de serina. A glicólise inducida polo HSV-1 incrementa o contido de ATP, o cal é vital para a replicación do virus.[19]
↑Shirakihara Y, Evans PR (1988). "Crystal structure of the complex of phosphofructokinase from Escherichia coli with its reaction products". J. Mol. Biol.204 (4): 973–94. PMID2975709. doi:10.1016/0022-2836(88)90056-3.
↑Peskov K, Goryanin I, Demin O (2008). "Kinetic model of phosphofructokinase-1 from Escherichia coli". J Bioinform Comput Biol6 (4): 843–67. PMID18763746. doi:10.1142/S0219720008003643.
↑Hellinga HW, Evans PR (1987). "Mutations in the active site of Escherichia coli phosphofructokinase". Nature327 (6121): 437–9. PMID2953977. doi:10.1038/327437a0.
↑Papagianni M, Avramidis N (2012). "Engineering the central pathways in Lactococcus lactis: functional expression of the phosphofructokinase (pfk) and alternative oxidase (aox1) genes from Aspergillus niger in Lactococcus lactis facilitates improved carbon conversion rates under oxidizing conditions". Enzyme and Microbial Technology51 (3): 125–30. PMID22759530. doi:10.1016/j.enzmictec.2012.04.007.
