PROFILPELAJAR.COM

Un esferoplasto é unha célula á cal se lle eliminou case completamente a parede celular pola acción da penicilina. Aplícase xeralmente a bacterias, pero tamén a outros microorganismos, por exemplo lévedos. O nome procede do feito que despois de que se dixire a parede celular dun microbio, a tensión da membrana causa que a célula adquira unha característica forma esférica. Os esferoplastos son osmoticamente fráxiles, e sofren lise se son transferidos a unha solución hipotónica.

Usos e aplicacións

Descubrimento de antibióticos

Desde a década de 1960 á de 1990 Merck and Co. usou o cribado de esferoplastos como método principal para o descubrimento de antibióticos que inhibían a biosíntese da parede celular. Neste cribado ideado por Eugene Dulaney, as bacterias en crecemento eran expostas a substancias de comprobación en condicións hipertónicas. Os inhibidores da síntese da parede celular causaron que as bacterias en crecemento formasen esferoplstos. Este cribado facilitou o descubrimento da fosfomicina, cefamicina C, tienamicina e varios carbapenems.^[1]

Patch clamp

Poden utilizarse esferoplastos xigantes especialmente preparadas de bacterias gramnegativas para estudar a función das canles iónicas bacterianas por medio dunha técnica electrofisiolóxica chamada patch clamp, que foi orixinalmente deseñada para caracterizar o comportamento das neuronas e outras células excitables. Para preparar esferoplastos xigantes, as bacterias cultívanse nun medio que contén substancias químicas que impiden que as células se dividan completamente. Isto causa que as bacterias formen longas "serpes" que comparten unha soa membrana e citoplasma. Despois dun período de tempo, as paredes celulares destas "serpes" son dixeridas, e as bacterias colápsanse formando grandes esferas rodeadas por unha soa bicapa lipídica. A membrana pode despois ser analizada nun aparato da patch clamp para determinar o fenotipo das canles iónicas incrustadas nela. Tamén é común sobreexpresar unha determinada canle para amplificar o seu efecto e facer que sexa así fácil de caracterizar.

A técnica do patch clamp aplicada a esferoplastos xigantes de Escherichia coli foron utilizados amplamente para o estudo das canles mecanosensitivas nativas (MscL, MscS e MscM) de E. coli desde 1987.^[2]^[3] Recentemente, o seu uso foi ampliado ao estudo doutras canles iónicas expresadas heterologamente e observouse que os esferoplastos xigantes de E. coli poden utilizarse como un sistema de expresión dunha canle iónica comparable aos ovocitos de Xenopus.^[4]^[5]^[6]^[7]

Lise celular

As células de lévedo están normalmente protexidas por unha grosa parede celular que fai que a extracción de proteínas sexa difícil. A dixestion encimática da parede celular con cimoliase, creando esferoplastos, fai que a célula sexa vulnerable a unha lise fácil con deterxentes ou cambios de presión osmolar rápidos.

As bacterias gramnegativas, como E. coli son sometidas á lise da parede externa por shock osmótico e a acción do encima lisozima e etilenediaminatetraacetato (EDTA), o axente quelante, coa subseguinte liberación do contido do espazo periplásmico e os esferoplastos que teñen o contido celular interno no medio de sacarosa. A lisozima cataliza a hidrólise da capa de peptidoglicano, mentres que a EDTA destrúe a membrana externa facilitando o acceso do encima ás capas internas da parede celular.^[8] Entre os encimas periplásmicos liberados durante a rotura da parede celular externa de E. coli están: unha fosfatase alcalina, unha fosfodiesterase cíclica, unha fosfatase ácida, e unha 5’-nucleotidase.^[9] O medio sacarosa-tris(hidroximetil)aminometano-HCl é esencial para a preservación da integridade dos encimas por lise. O EDTA axuda a hidrólise celular pola unión de ións divalentes, como o Ca²⁺, e eliminándoas da parede abrandando así a parede para unha ulterior acción da lisozima.^[10]

Transfección

Os esferoplastos bacterianos, cun ADN recombinante axeitado inserido nel, poden utilizarse para transfectar células animais. Os esferoplastos con ADN recombinantes son introducidos nos medios que conteñen células animais e son fusionados polo polietilenglicol (PEG). Con esta metodoloxía, case o 100% das células animais poden captar o ADN alleo.^[11] Facendo experimentos que seguían o protocolo de Hanahan modificado usando cloruro de calcio en E. coli, determinouse que os esferoplastos poden transformar cunha eficiencia de 4,9x10⁻⁴.^[12]

Notas

↑ Silver, L.L. Rational approaches to antibiotic discovery: pre-genomic directed and phenotypic screening, 2.4.2 Screens for spheroplast formation. In: Thomas Dougherty, Michael J. Pucci, Antibiotic Discovery and Development. Chap. 2, p. 46.
↑ Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., and Kung, C. (1987) Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2297-2301.
↑ Blount, P., Sukharev, S. I., Moe, P. C., Martinac, B., and Kung, C. (1999) Mechanosensitive channels of bacteria. Methods in Enzymology 294, 458-482.
↑ Santos, J. S., Lundby, A., Zazueta, C., and Montal, M. (2006) Molecular template for a voltage sensor in a novel K+ channel. I. Identification and functional characterization of KvLm, a voltage-gated K+ channel from Listeria monocytogenes. Journal of General Physiology 128(3), 283-292.
↑ Nakayama, Y., Fujiu, K., Sokabe, M., and Yoshimura, K. (2007) Molecular and electrophysiological characterization of a mechanosensitive channel expressed in the chloroplasts of Chlamydomonas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 5883-5888.
↑ Kuo, M. M.-C., Baker, K. A., Wong, L., and Choe, S. (2007) Dynamic oligomeric conversions of the cytoplasmic RCK domains mediate MthK potassium channel activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 2151-2156.
↑ Kuo, M. M.-C., Saimi, Y., Kung, C., and Choe, S. (2007). Patch-clamp and phenotypic analyses of a prokaryotic cyclic nucleotide-gated K+ channel using Escherichia Coli as a host. J. Biol. Chem. 282, 24294-24301.
↑ Tortora, Gerard; Funke, Berdell; Case, Christine (2016). Microbiology: An Introduction. United States: Pearson. pp. 84. ISBN 0-321-92915-2.
↑ Neu, Harold C.; Heppel, Leon A. (September 1, 1965). "The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts.". The Journal of Biological Chemistry 240 (9): 3685–3692. PMID 4284300.
↑ Ninfa, Alexander J.; Ballou, David P.; Benore, Marilee (2010). Fundamental Laboratory Approaches for biochemistry and Biotechnology. (2nd ed.). United States of America: John Wiley & Sons, Inc. pp. 234. ISBN 978-0-470-08766-4.
↑ Gietz, R. D.; Woods, R. A. (2001-04-01). "Genetic transformation of yeast". BioTechniques 30 (4): 816–820, 822–826, 828 passim. ISSN 0736-6205. PMID 11314265.
↑ "The Effect of Spheroplast Formation on the Transformation Efficiency in Escherichia coli DH5α". ResearchGate (en inglés). Consultado o 2017-05-07.