La US 65 entre dans le coin sud-est de l'Arkansas au nord de Gassoway, Louisiane. Elle se dirige vers le nord en passant par Eudora, Lake Village, McGehee et Dumas. Elle bifurque ensuite vers le nord-ouest en direction de Pine Bluff.
La route contoune la ville en multiplex avec l'I-530 sur toute la longueur de l'autoroute, jusqu'à Little Rock, au nord-ouest, en passant par White Hall, Redfield et Lakeside. Alors qu'elle arrive à Little Rock, l'I-530 prend fin à la jonction avec l'I-30 et l'I-440. La US 65 continue en multiplex avec l'I-30 jusqu'à la jonction avec l'I-40 à North Little Rock. Elle forme alors un multiplex avec l'I-40 vers le nord-ouest jusqu'à Conway, où elle quitte l'autoroute et poursuit seule vers le nord. Elle passe alors par Greenbrier, Clinton et Marshall avant de traverser la rivière Buffalo près de Tyler Bend. Au sud de Harrison, la route rejoint brièvement la US 62 / US 412 en se dirigeant vers le nord-ouest dans la ville avant de se séparer à Bear Creek Springs. Elle continue comme route rapide à quatre voies jusqu'au Missouri.
La US 65 entre en Iowa à Lineville. Elle se dirige vers le nord, rencontre la US 69 et atteint la région métropolitaine de Des Moines. Les deux routes se séparent et la US 65 forme la route de ceinture à l'est de la ville. Elle forme un très court multiplex avec l'I-80 au nord-est de Des Moines et se dirige vers le nord-est. Au nord de Mingo, elle bifurque vers le nord en étant parallèle à l'I-35. Elle traverse les villes de Collins, Colo, Hubbard, Iowa Falls, Hampton, Sheffield, Mason City et Northwood, au nord de laquelle la US 65 atteint la frontière avec le Minnesota. Sur la majeure partie de son parcours, la US 65 est une route rurale à deux voies.
Minnesota
La US 65 entre au Minnesota à Gordonsville. Elle traverse Glennville et atteint une première jonction avec l'I-35 au sud-est d'Albert Lea. La route entre dans la ville, traverse le centre-ville et rejoint à nouveau l'I-35, intersection qui, cette fois, constitue son terminus nord.
I-530 / US 63 / US 79 à Pine Bluff. L'I-530 / US 65 forment un multiplex jusqu'à Little Rock. La US 63 / US 65 / US 79 forment un multiplex dans la ville.