Pyruvaattikinaasi on entsyymi, joka katalysoi glykolyysin viimeistä vaihetta. Siinä fosfaattiryhmä siirretään fosfoenolipuryvaatilta ADP-molekyylille, jolloin syntyy pyruvaattia ja ATP-molekyyli. ^[1]

Reaktio tapahtuu siirtämällä fosfaattiryhmä fosfoenolipuryvaatilta ADP:lle ^[2]. Fosfaattiryhmän poistaminen johtaa kemiallisesti pysymättömään enoliin, joka muuntuu nopeasti pysyvämpää ketonimuotoon pyruvaatiksi. ^[1]

Massaltaan pyruvaattikinaasi on eliöstä riippuen noin 54–2 000 kilodaltonia. Entsyymiin on kiinnittynyt magnesium- ja kalium-ioneja, jotka ovat tärkeitä entsyymin toiminnalle. Yhdisteitä, jotka aktivoivat entsyymiä ovat muun muassa glukoosi-6-fosfaatti ja fruktoosi-6-fosfaatti. Pyruvaatikinasin inhibiittoreita ovat ATP, sitraatit, alaniini sekä eräiden metallien kuten kuparin, nikkelin ja sinkin ionit. Parhaiten entsyymi toimii lämpötilan ollessa eliöstä riippuen 15–98 °C välillä ja pH 4,5–8. ^[2]

Perinnällisessä hemolyyttisessä anemiassa pyruvaattikinaasin määrä on liian alhainen. Tässä sairaudessa glykolyysi on huomattavasti hitaampi ja näin ollen myös energian saanti heikompaa erityisesti punasoluissa, joissa ei tapahdu sitruunahappokiertoa. ^[3]