Guillermo murió cuando Margarita tenía 8 años. Ella y sus hermanos María y Bonifacio fueron confiados a su madre, quien regentó Monferrato mientras su hijo fue menor de edad.
Federico II Gonzaga, marqués de Mantua, desposó a la pequeña María Paleólogo cuando ésta tenía 8 años, por lo que el matrimonio no podía ser consumado. Durante la espera tomó como amante a Isabella Boschetti, con quien tuvo un hijo natural: Alejandro.
Al estallar la guerra franco-española por la conquista del ducado de Milán, Federico se alió con Carlos I de España, quien le propuso que se casara con Julia de Aragón, pero su familia rechazó la unión. María, sin embargo, murió en 1530 antes de poder consumar su matrimonio.
Ese mismo año falleció también Bonifacio, el único heredero de su padre. Para Federico, por lo tanto, se volvió muy conveniente contraer matrimonio con Margarita, ya que esto lo convertía en marqués de Monferrato. Para la madre de la muchacha su matrimonio era un medio para defender el marquesado de los franceses de Saboya.
Fue así como Margarita se casó con Federico en Mantua el 3 de octubre de 1531, y como única heredera de Monferrato unió sus posesiones con los dominios de los Gonzaga.
En 1540 Federico murió de sífilis y el título pasó a Francisco, el primogénito, quien tenía 7 años de edad. Por lo tanto Margarita se convirtió en regente junto con sus cuñados, Ercole Gonzaga y Ferrante I Gonzaga, hasta que el duque cumpliera la mayoría de edad. Durante este período, el buen gobierno de Margarita y sus cuñados trajo estabilidad financiera y la creación de nuevas industrias a la ciudad.
Al poco tiempo también se organizó un contrato matrimonial del joven con Catalina de Habsburgo, hija de Fernando I de Habsburgo. La boda se celebró el 22 de octubre de 1549, pero duró poco tiempo, ya que el joven novio falleció de pulmonía a los pocos meses.
El título pasó así al segundo hijo de Margarita, Guillermo, quien tenía 12 años. Una vez más, la regencia recayó en Margarita y sus cuñados.
Durante este segundo período de regencia se instituyó el Magisterio de la Rota, la constitución de una medida física para el peso y las medidas, el mejoramiento del puerto de Mantua y la fortificación de las defensas.
A pesar de esto, el 2 de marzo de 1555 los franceses lograron conquistar Monferrato y lo conservaron hasta la paz de Cateau-Cambrésis de 1559.
En 1556 terminó la regencia y Guillermo se ocupó solo del gobierno. En 1559 quiso efectuar un cambio cediendo Monferrato a España a cambio de Cremona. Esta idea fue rechazada por su tío Ercole y por todos los habitantes que esperaban tener autonomía, y para traer nuevamente la calma, se entregó el gobierno a un nativo, es decir, a Margarita.
Margarita murió el 28 de diciembre de 1566 y su nieta Margarita Gonzaga d'Este fue nombrada así en su honor.
Matrimonio e hijos
Federico Gonzaga y Margarita Paleólogo de Monferrato tuvieron siete hijos:
Francisco (10 de marzo de 1533-21 de febrero de 1550), duque de Mantua y marqués de Monferrato, casado en 1549 con Catalina de Habsburgo (15 de septiembre de 1533 - 28 de febrero de 1572).
Luis (1539-1595), duque consorte de Nevers y de Rethel por su matrimonio con Maria Enriqueta de Nevers (3 de septiembre de 1571 - 3 de septiembre de 1601) hija de Francisco I, duque de Nevers. Estos títulos también pasaron a la Casa Gonzaga por la extinción de la línea legítima masculina.