Matthias Matschke wurde als Sohn eines diplomierten Ingenieurs und einer Religionslehrerin in Marburg geboren und wuchs im Dorf Hahn (heute zu Ober-Ramstadt) bei Darmstadt auf.[1][2] Bevor Matthias Matschke Schauspieler wurde, ging er auf das Ludwig-Georgs-Gymnasium in Darmstadt; danach studierte er die Fächer Deutsch und Religion auf Lehramt. Vor der Aufnahme dieses Studiums war er an der Otto-Falckenberg-Schule in München abgelehnt worden.
Von 2005 bis 2020 spielte Matschke in der Comedy-Serie PastewkaBastian Pastewkas Halbbruder Hagen. Von 2003 bis 2013 gehörte er auch zum Ensemble der Sketch-Sendung Ladykracher.
Matschke spielt seit der Saison 2010/11 im Wiener Burgtheater in Der ideale Mann und war 2012–2013 im Akademietheater Wien als Leiter des Fortgangs in Einige Nachrichten an das All zu sehen.
Seit Oktober 2015 tritt Matthias Matschke als „Dr. Matthias Matschke“ in der satirischen Nachrichtensendung heute-show auf. Ebenfalls war er ab Oktober 2015 Bestandteil des Ensembles der Sketch-Comedy-Serie Sketch History, in der historische Ereignisse parodiert wurden. Matschke schlüpfte dort unter anderem in die Rollen von Ludwig van Beethoven, Joseph Goebbels und John F. Kennedy.
2000: Matschkes Spiegelkabinett von Matthias Matschke und Johannes Grebert als Matthias an der Volksbühne Berlin (Regie: Matthias Matschke und Johannes Grebert)
2000–2001: Caligula – Das obszöne Werk von Frank Castorf nach Georges Bataille als Scipio an der Volksbühne Berlin (Regie: Frank Castorf)
2000–2002: Endstation Amerika nach Tennessee Williams als Steve Hubbel an der Volksbühne Berlin (Regie: Frank Castorf)