Johanna Wokalek entstammt einer Familie siebenbürgischer Ärzte und Apotheker. Sie wurde als zweites von vier Kindern des Hautarztes Heinrich-Franz Wokalek und seiner Frau Angelika, geb. Bettermann, in Freiburg geboren und wuchs in den Freiburger Stadtteilen Neuburg und Wiehre auf.[1][2] Während ihrer Schulzeit am Friedrich-Gymnasium Freiburg entdeckte Wokalek ihre Liebe zum Theaterspielen. Nach dem Abitur wurde sie am Max-Reinhardt-Seminar in Wien aufgenommen.[3] Noch während ihres Studiums (1994 bis 1998) war sie in dem Film Aimée & Jaguar neben Maria Schrader und Juliane Köhler als Ilse zu sehen.
2019 kehrte Johanna Wokalek für Die Ratten in der Inszenierung von Andrea Breth an das Wiener Burgtheater zurück. In dem Jahr war sie an der Seite von Maik Solbach erstmals im Tanztheater von Pina Bausch Er nimmt sie an die Hand und führt sie in das Schloß, die anderen folgen in Wuppertal zu erleben. 2020 setzte sie dort die Zusammenarbeit mit den Sieben Todsünden. Teil II: Fürchtet euch nicht fort.
2010 stellte Wokalek in Die kommenden Tage die in den Terrorismus abgleitende Cecilia Kuper dar. 2012 spielte sie die Hauptrolle der Tiffany Blechschmid in Sherry Hormanns Film Anleitung zum Unglücklichsein. 2013 war sie Hauptdarstellerin im Musikvideo zu dem Song Halo der britischen Popgruppe Depeche Mode, die das Video für die Bühnenshow ihrer Delta-Machine-Tour 2013/14 benutzte. In der daraufhin erscheinenden Live-DVD Depeche Mode Live in Berlin hatte sie zusätzlich einen Cameo-Auftritt als Hure bei der Akustik-Session im Berliner Bordell Bel Ami.[6]
2017 spielte Wokalek die Claire Kornitzer in Matthias Glasners ZDF-Zweiteiler Landgericht – Geschichte einer Familie[7] sowie die Nora in dem Kinofilm Freiheit von Jan Speckenbach, der im Wettbewerb des Locarno Festivals lief. Landgericht – Geschichte einer Familie wurde 2018 mit dem Grimme-Preis ausgezeichnet.
2019 war Wokalek als Ditte Nansen in Christian Schwochows Neuverfilmung Deutschstunde des gleichnamigen Romans von Siegfried Lenz zu sehen. Im selben Jahr spielte sie die Linda in Jonas Alexander Arnbys Drama Suicide Tourist – Es gibt kein Entkommen.