Родина Гаттілузіо походила з Генуезької республіки. Батьки Нікколо та його брата Франческо I Гаттілузіо невідомі, хоча на основі геральдичних свідчень їхніх написів Ентоні Латтрелл стверджує, що їхня мати була членом родини Доріа[2]. Франческо здобув прихильність візантійського імператора Іоанна V Палеолога, допомігши йому у 1354 році потіснити суперника з престолу, Іоанна VI Кантакузина. Як винагороду Франческо Гаттілузіо з липня 1355 року отримав володіння островом Лесбос (і його головним містом Мітилена), а також одружився з сестрою імператора Марією Палеолог[3][4]. Нікколо, в свою чергу у певний момент між 1376 і 1379 роками[2] отримав в управління прибережне фракійське місто Айнос.
З 1384 по 1387 рік він служив регентом свого племінника, праителя Лесбоса Франческо II Гаттілузіо, поки вони не посварилися між собою[5]. Коли його племінник загинув під час полювання, Нікколо знову став регентом, цього разу для сина Франческо Якопо[6].
Відомо, що у нього була дочка Марієтта, хоча ім'я її матері не записано; вона померла раніше за нього[7]. На посаді правителя Айноса Нікколо змінив його внучатий племінник Паламед[8].
