Здобув традиційну єврейську початкову освіту в хедері. Визнавав, що «лише в тринадцять років почав навчатися систематично світським наукам та російській мові». У 1905 вступив у реальне училище в Ризі й у 1908 році закінчив його. У 1911 вступив до Київського комерційного інституту, але не закінчив його — був виключений за участь у студентських заворушеннях. З 1915 по 1918 також навчався на юридичному факультеті Санкт-Петербурзького державного університету.
З 1939 року — член Художньої ради Комітету у справах мистецтв при РНК СРСР.
Одночасно з театральною роботою викладав в училищі при Московському єврейському театрі (з 1941 — професор.
В 1941, під час Радянсько-німецької війни разом з театром відправився в евакуацію до Ташкенту, де брав участь в роботі також Узбецького театру драми ім. Хамзи, а також Узбецького державного театру опери та балету.
У лютому 1942, коли з ініціативи радянського керівництва для «залучення до боротьби з фашизмом єврейських народних мас в усьому світі» був створений Єврейський антифашистський комітет (ЄАК), став першим головою цього комітету. В 1943 від ЄАК їздив до США, Канади, Мексики і Великої Британії з пропагандистськими завданнями організації фінансової підтримки воєнних дій СРСР.
Був членом Президії Всеросійського театрального товариства і ЦК профспілки працівників мистецтв.
Сім'я
Був одружений з Сарою Львівною Кантор (померла в 1932), пізніше з Анастасією Павлівною Потоцькою. Від першого шлюбу мав двох дочок, Ніну і Наталію (в 1970-і роки виїхали в Ізраїль, померли в кінці 2014 року). Ніна Міхоелс викладала в Державному інституті театрального мистецтва. Зять — композитор Мойсей Вайнберг.
Загибель
Згідно з версією, оприлюдненою для громадськості одразу після загибелі, Міхоелс уночі проти 13 січня1948, під час відрядження в Мінськ, разом з колегою, театрознавцем В. І. Голубовим (Потаповим), внаслідок нещасного випадку був збитий вантажівкою і помер. Похорони проводились на державному рівні, були випущені пам'ятні збірки. Єврейському театру було присвоєно ім'я Міхоелса. Того ж 1948 ЄАК був розпущений, а більшість його учасників незабаром піддана репресіям. У липні 1949 був закритий Єврейський театр. Організатори та виконавці вбивства Міхоелса були нагороджені державними нагородами.
На початку квітня 1953, після арешту колишнього міністра держбезпеки СРСРВ. С. Абакумова, за ініціативою міністра внутрішніх справ Л. П. Берії було проведено розслідування, яке показало, що Міхоелс, а також його супутник (що був таємним інформатором МГБ) були навмисне вбиті групою офіцерів МГБ під керівництвом генерал-лейтенантів С. І. Огольцова і Л. Х. Цанава (глава МГБ БССР) і полковника Ф. Г. Шубнякова. Згідно зі свідченнями Абакумова, це сталося за прямою особистою вказівкою Сталіна. Вбивство було скоєно на дачі Лаврентія Цанава в мінській Степянці, після чого тіла були роздушені вантажівкою та покинуті на розі безлюдних вулиць Білоруської та Ульянівської Мінська.
Вважається, що однією з основних причин вбивства стало переконання Сталіна щодо підсилення єврейського націоналізму в СРСР через діяльність Єврейського антифашистського комітету.