Türkiye 3. Ligi 2000-2001 sezonu Türkiye'nin en üst düzey üçüncü kademe ligi olarak 3 Eylül 2000 ile 27 Mayıs 2001 tarihleri arasında oynanmıştır. Söz konusu sezon Türkiye'de üç kademeli profesyonel liglerin son sezonu olmuş olup, bu sezon sonundan itibaren geçerli olacak olan dört kademeli profesyonel lige geçiş gerçekleştirilmiştir. Bu sezone kadar en üst üçüncü profesyonel lig olan 3. Lig yeni sezon öncesinde oluşturulan Türkiye 2. Futbol Ligi B Kategorisi'nin bu unvanı alması ile birlikte dördüncü profesyonel lig olmuştur.
Bu sezonda kendi gruplarında ilk üç sırada yer alan takımlar kademe olarak aynı kademede kalmış olmakla birlikte yeni oluşturulan Türkiye 2. Futbol Ligi B Kategorisi'ne yükseltilmiş, son dört takım yerel amatör liglere düşürülmüştür. 1.Grup'ta yer alan Bitlis Özgüzelderespor son üç mücadelesine trafik kazası geçirdiği için çıkamamış ve hükmen 3-0 mağlup ilan edilmiştir.[2] Yaşanan bu olay neticesinde TFF tarafından küme düşürülmeyen kulübün ardından grupta sadece üç takım küme düşürülmüştür.Bu sıralamanın dışında ligi bitiren takımlar lig mücadelesi sonucunda bir alt lige düşmemiş olsa da, oluşturulan yeni kademenin etkisi ile birlikte bir alt kademede yer alacak şekilde dördüncü kademede konumlandırılmıştır.