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ChIP-seq, ou imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento, é uma técnica usada para investigar de forma ampla proteínas de ligação ao DNA, modificações de histonas ou nucleossomos ^[1]. Este método permite identificar locais de ligação proteína-DNA in vivo em escala genômica ^[2]. Ao combinar o ChIP com o sequenciamento de DNA de alto rendimento, identificam-se os sítios de ligação das proteínas associadas à cromatina, fornecendo informações sobre a regulação da transcrição gênica em células eucarióticas ^[3] e definindo regulons bacterianos ^[2].

ChIP-seq tornou-se o principal método para investigar os efeitos dos fatores de transcrição em todo o genoma^[4]. É comumente combinado com análise de microarranjos (ChIP) ou sequenciamento de nova geração para traçar a distribuição das proteínas de ligação ao DNA em todo o genoma ^[5]. A técnica, quando combinada com microarranjos e sequenciamento de segunda geração, é fundamental para responder perguntas sobre os sítios de ligação de proteínas ao longo do genoma ^[6].

Usos

O principal uso de ChIP-seq é investigar o efeito de fatores de transcrição e outras proteínas de ligação ao DNA para um dado fenótipo. ^[7] Determinar como as proteínas se ligam ao DNA e como suas estruturas regulam a expressão do gene é essencial para a plena compreensão de muitos processos biológicos e estados de doença. Estas informações epigenéticas são complementares para o genótipo e análise de expressão por sequencimanento de RNA. ChIP-seq é uma alternativa para ChIP-chip, que requer uma matriz de hibridação e necessariamente introduz um viés, pois uma matriz é restrito a um número fixo de sondas.

Sítios específicos de DNA em interação física direta com fatores de transcrição e outras proteínas podem ser isoladas por imunoprecipitação da cromatina. Através de ChIP é produzida uma biblioteca de sítios de DNA alvo ligados a uma proteína de interesse in vivo. Análises do sequenciamento massivamente paralelo são utilizadas em conjunto com bases de dados de genomas completos para analisar o padrão de interação de qualquer proteína com o DNA, ^[8] ou o padrão de qualquer modificação epigenética da cromatina. Isso pode ser aplicado para o conjunto "ChIP'ável" de proteínas e modificações, tais como fatores de transcrição, polimerases e maquinário de transcrição, proteínas estruturais, modificações proteicas, e de modificações do DNA.^[9]

Metodologia

Imunoprecipitação cromatina (ChIP)

A imunoprecipitação por cromatina é um método utilizado para a acumulação específica de sequências de DNA curtas associadas à proteína de interesse em células vivas células vivas.^[10] Um procedimento típico inclui as seguintes etapas:

Formação de ligações cruzadas reversíveis entre DNA e proteínas interagindo com ele;
Isolamento de DNA e clivagem em fragmentos por ultra-sonografia ou endonucleases;
Precipitação por anticorpos específicos contra a proteína de interesse;
Destruição de ligações cruzadas entre proteína e DNA, purificação de DNA.

Como resultado, é possível identificar especificamente os fragmentos de DNA com os quais a proteína em estudo estava ligada.

Essa técnica tem várias limitações. Portanto, geralmente para a ChIP, é necessário um número significativo de células (cerca de 10 milhões), o que dificulta a utilização desse método em organismos modelo pequenos e também limita o número de experimentos que podem ser realizados com uma amostra valiosa. Um número de métodos foi desenvolvido para superar esta limitação, por exemplo Nano-ChIP-seq ^[11]

Referências

↑ Park, Peter J. (outubro de 2009). «ChIP–seq: advantages and challenges of a maturing technology». Nature Reviews Genetics (em inglês) (10): 669–680. ISSN 1471-0056. PMC PMC3191340 Verifique |pmc= (ajuda). PMID 19736561. doi:10.1038/nrg2641. Consultado em 12 de maio de 2024
↑ ^a ^b Myers, Kevin S.; Park, Dan M.; Beauchene, Nicole A.; Kiley, Patricia J. (setembro de 2015). «Defining bacterial regulons using ChIP-seq». Methods (em inglês): 80–88. PMC PMC4577457 Verifique |pmc= (ajuda). PMID 26032817. doi:10.1016/j.ymeth.2015.05.022. Consultado em 12 de maio de 2024
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↑ http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_chip_sequence.pdf
↑ Kaboord, Barbara, and Maria Perr. “Isolation of Proteins and Protein Complexes by Immunoprecipitation.” Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 424 (2008): 349–64. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-064-9_27.
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