Masolino gikk sannsynligvis i lære hos billedhuggeren Lorenzo Ghiberti på begynnelsen av 1400-tallet. Masolinos mest omtalte verk er freskene i kirken Santa Maria del Carmine i Firenze, som han utførte sammen med den 18 år yngre Masaccio i 1425–1428. Til tross for aldersforskjellen var det Masaccio som påvirket Masolino snarere enn omvendt. Masolino var utdannet i en gotisk, dekorativstil som han ikke kunne eller ville frigjøre seg fra. Giorgio Vasari omtaler Masolino i sin kunstnerbiografi.
Sankt Katarinas kapell
I basilikaenSan Clemente i Roma har Masolino, sannsynligvis med assistanse av Masaccio, utført en serie fresker i Sankt Katarinas kapell med motiv fra Sankt Katarinas liv. Freskene ble utført 1428–1431 på oppdrag fra kardinal Branda Castiglione.
Utvalgte verk
«Madonnaen og barnet» (1423) (nå i Kunsthalle, Bremen)