Van Cleef begynte arbeidslivet som revisor. Han tjenestegjorde i United States Navy under andre verdenskrig, og etter krigen begynte han å spille amatørteater. Hans første rolle var i Sheriffen (1952) hvor hans spesielle utseende, med skarp nese og smale øyne, gav ham et minneverdig ansikt som førte til at han fikk medvirke i et stort antall westernfilmer, som regel i skurkeroller. Resten av tiåret og fram til begynnelsen av 1960-tallet spilte han for det meste biroller, mange av dem i vel ansette filmer som John Sturges'Oppgjør i O.K. Corral (1957), Budd BoettichersRi ensom (1959) og John FordsMannen som skjøt Liberty Valance (1962).
I 1965 fikk Van Cleef rollen som den tøffe men rettferdige oberst Mortimer i Sergio LeonesFor en neve dollar mer, hvor han spilte mot Clint Eastwood i Italia. Dette var Van Cleefs store internasjonale gjennombrudd, og han vendte tilbake til Europa for å spille i mange spaghettiwesterns i løpet av 1960- og 1970-tallet.
Lee Van Cleef døde av hjerteinfarkt den 16. desember 1989 og ble begravet på Forest Lawn Memorial Park i Hollywood Hills.[6]
Innflytelse
Van Cleef personifiserte den ultimate western-dusørjegeren, og var av den grunn inspirasjonen til mange etterfølgere, bl.a. i Lucky Luke-seriealbumet Dusørjegeren, hvor rollefiguren Elliot Belt har lånt hans trekk.