In 1860 werd hij door de Republikeinen aangeduid als kandidaat voor het vicepresidentschap, een functie die hij uitoefende van 1861 tot 1865 tijdens de eerste ambtstermijn van president Abraham Lincoln. Hij besteedde maar weinig tijd aan het voorzitten van de plenaire vergaderingen van de Senaat, maar was wel een grote voorstander van de oorlog tegen de Geconfedereerde Staten van Amerika om de slavernij af te schaffen. In 1864 nam de toen 55-jarige vicepresident dienst op een oorlogsschip in zijn thuisstaat Maine, waarop hij twee maanden lang fungeerde als kok. Tot Hamlins ontgoocheling nam Lincoln in 1864 Andrew Johnson als running mate.
Hamlin werd herkozen in de Senaat in 1869 en diende nog twee termijnen. Hij was in 1881-1882 ambassadeur in Spanje.
Hij overleed op 4 juli 1891, de dag van de onafhankelijkheid, op 81-jarige leeftijd.