A transferencia de enerxía de resonancia de Förster ou FRET (do inglés Förster resonance energy transfer), tamén chamada transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia, transferencia de enerxía de resonancia ou RET (do inglés resonance energy transfer) ou transferencia de enerxía electrónica ou EET (do inglés electronic energy transfer) é un mecanismo que describe a transferencia de enerxía producida entre dúas moléculas sensibles á luz (cromóforos).^[1] Un cromóforo doante, inicialmente no seu estado electrónico excitado, pode transferir enerxía a un cromóforo aceptor por medio de acoplamento dipolo-dipolo non radiativo.^[2] A eficiencia desta transferencia de enerxía é inversamente proporcional á sexta potencia da distancia entre o doante e o aceptor, o que fai que a FRET sexa extremadamente sensible a pequenos cambios na distancia.^[3][4]

As medidas de eficiencia da FRET poden utilizarse para determinar se dous fluoróforos están a unha certa distancia un do outro.^[5] Tales medidas utilízanse como unha ferramenta de investigación en campos como a bioloxía e a química.

A FRET é análoga á comunicación de campo próximo en que o raio de interacción é moito menor que a lonxitude de onda da luz emitida. Na rexión do campo próximo, o cromóforo excitado emite un fotón virtual que é absorbido instantaneamente por un cromóforo receptor. Estes fotóns virtuais son indetectables, xa que a súa existencia viola a conservación da enerxía e do momento, e, por tanto, a FRET considérase un mecanismo sen radiación. Os cálculos de electrodinámicos cuánticos foron utilizados para determinar que a transferencia de enerxía sen radiación (FRET) e a radiativa son as asíntotas de curto e longo rango dun único mecanismo unificado.^[6][7][8]

A transferencia de enerxía de resonancia de Förster recibe ese nome polo científico alemán Theodor Förster.^[9] Cando ambos os cromóforos son fluorescentes, o termo que se adoita usar é "transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia", aínda que a enerxía non se transfire realmente por fluorescencia.^[10][11] Para evitar interpretacións erróneas do fenómeno, que é sempre unha transferencia non radiativa de enerxía (incluso cando ocorre entre dous cromóforos fluorescentes), é preferible usar o nome "transferencia de enerxía de resonancia de Förster" mellor que "transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia"; porén, esta última denominación ten un uso común na literatura científica.^[12] A FRET non está restrinxida á fluorescencia e ocorre tamén en conexión coa fosforescencia.^[10]

A eficiencia da FRET (${\displaystyle E}$) é o rendemento cuántico da transcición de transferencia de enerxía, é dicir, a probabilidade de que ocorra un evento de transferencia de enerxía por evento de excitación do doante:^[13]

${\displaystyle E={\frac {k_{\text{ET}}}{k_{f}+k_{\text{ET}}+\sum {k_{i}}}},}$

onde ${\displaystyle k_{f}}$ a taxa de decaimento radiativo do doante, ${\displaystyle k_{\text{ET}}}$ é a taxa de transferencia de enerxía, e ${\displaystyle k_{i}}$ as taxas de calquera outra vía de desexcitación excluíndo as transferencias de enerxía a outros aceptores.^[14][15]

A eficiencia da FRET depende de moitos parámetros físicos,^[16] que se poden agrupar así: 1) a distancia entre o doante e o aceptor (tipicamente no rango de 1–10 nm), 2) o solapamento espectral do espectro de emisión do doante e o espectro de absorción do aceptor, e 3) a orientación relativa do momento dipolar da emisión do doante e do momento dipolar de absorción do aceptor.

${\displaystyle E}$ depende da distancia de separación entre doante e aceptor ${\displaystyle r}$ cunha lei inversa á 6ª potencia debida ao mecanismo de acoplamento dipolo-dipolo:

${\displaystyle E={\frac {1}{1+(r/R_{0})^{6}}}}$

sendo ${\displaystyle R_{0}}$ a distancia de Förster deste par de doante e aceptor, é dicir, a distancia á cal a eficiencia da transferencia de enerxía é do 50 %.^[14] A distancia de Förster depende da integral de solapamento do espectro de emisión do doante co espectro de absorción do aceptor e as súas mutuas orientacións moleculares como se expresan na seguinte ecuación, toda en unidades do SI:^[17][18][19]

${\displaystyle {R_{0}}^{6}={\frac {2.07}{128\,\pi ^{5}\,N_{A}}}\,{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}J}$

onde ${\displaystyle Q_{\text{D}}}$ é o rendemento cuántico da fluorescencia do doante en ausencia do aceptor, ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ é o factor de orientación do dipolo, ${\displaystyle n}$ é o índice de refracción do medio, ${\displaystyle N_{\text{A}}}$ é a constante de Avogadro, e ${\displaystyle J}$ é a integral do solapamento espectral calculada como

${\displaystyle J={\frac {\int f_{\text{D}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda }{\int f_{\text{D}}(\lambda )\,d\lambda }}=\int {\overline {f_{\text{D}}}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda ,}$

onde ${\displaystyle f_{\text{D}}}$ é o espectro de emisión do doante, ${\displaystyle {\overline {f_{\text{D}}}}}$ é o espectro de emisión do doante normalizado a unha área de 1, e ${\displaystyle \epsilon _{\text{A}}}$ é o coeficiente de extinción molar do aceptor, obtido normalmente a partir dun espectro de absorción.^[20] O factor de orientación κ vén dado por

${\displaystyle \kappa ={\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {\mu }}_{\text{D}}-3({\hat {\mu }}_{\text{D}}\cdot {\hat {R}})({\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {R}}),}$

onde ${\displaystyle {\hat {\mu }}_{i}}$ denota o momento dipolar de transición normalizado do fluoróforo respectivo, e ${\displaystyle {\hat {R}}}$ denota o desprazamento interfluoróforo normalizado.^[21] ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ = 2/3 é o que se adoita usar. Este valor obtense cando ambas as tinguiduras son libres de rotar e poden considerarse orientadas isotropicamente durante o tempo de vida do estado excitado. Se a tinguidura é fixa ou non é libre de rotar, entón ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ = 2/3 non se pode tomar como valor válido. Porén, na maioría dos casos, incluso unha lixeira reorientación das tinguiduras ten como resultado unha suficiente media orientacional para que ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ = 2/3 non supoña un grande erro na estimación da distancia de transferencia de enerxía debido á dependencia da sexta potencia do ${\displaystyle R_{0}}$ sobre ${\displaystyle \kappa ^{2}}$. Incluso cando ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ é bastante diferente de 2/3, o erro pode ser asociado cun cambio en ${\displaystyle R_{0}}$, e así as determinacións dos cambios na distancia relativa para un sistema particular son aínda válidos. As proteínas fluorescentes non se reorientan nunha escala de tempo que sexa máis rápida que o seu tempo de vida de fluorescencia. Neste caso 0 ≤ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ≤ 4.^[20]

As unidades dos datos non están xeralmente nas unidades do SI. Usar as unidades orixinais para calcular a distancia de Förster é moitas veces máis conveniente. Por exemplo, a lonxitude de onda adoita estar en nanómetros e o coeficiente de excitación en ${\displaystyle M^{-1}cm^{-1}}$, onde ${\displaystyle M}$ é a concentración en ${\displaystyle mol/L}$. O valor de ${\displaystyle J}$ obtido a partir destas unidades virá dado en ${\displaystyle M^{-1}cm^{-1}nm^{4}}$. Para usar como unidade o ángstrom (Å) (${\displaystyle 10^{-10}m}$) para ${\displaystyle R_{0}}$, a ecuación é axustada a^{[17][22][23][24]}

${\displaystyle {R_{0}}^{6}=8.785\times 10^{-5}{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}J}$ (Å${\displaystyle ^{6}}$)

Para análises de FRET dependentes do tempo, pode usarse no seu lugar directamente a taxa de transferencia de enerxía (${\displaystyle k_{\text{ET}}}$):^[17]

${\displaystyle k_{\text{ET}}=({\frac {R_{0}}{r}})^{6}\,{\frac {1}{\tau _{D}}}}$

onde ${\displaystyle \tau _{D}}$ é o tempo de vida media da fluorescencia do doante en ausencia do aceptor.

A eficiencia da FRET relaciónase co rendemento cuántico e o tempo de vida da fluorescencia da molécula doante como segue:^[25]

${\displaystyle E=1-\tau '_{\text{D}}/\tau _{\text{D}},}$

onde ${\displaystyle \tau _{\text{D}}'}$ e ${\displaystyle \tau _{\text{D}}}$ son os tempos de vida da fluorescencia do doante en presenza e ausencia dun aceptor, respectivamente, ou como

${\displaystyle E=1-F_{\text{D}}'/F_{\text{D}},}$

onde ${\displaystyle F_{\text{D}}'}$ e ${\displaystyle F_{\text{D}}}$ son as intensidades de fluorescencia do doante con e sen aceptor, respectivamente.

A dependencia da distancia á inversa da sexta potencia da transferencia de enerxía de resonancia de Förster foi confirmada experimentalmente por Wilchek, Edelhoch e Brand^[26] usando péptidos triptofil. Stryer, Haugland e Yguerabide^{[27][28][29][Cómpre referencia][30]} tamén demostraron experimentalmente a dependencia teórica da transferencia de enerxía de resonancia de Förster na integral solapada. Os cálculos das distancias da FRET dalgúns exemplos de pares de tinguiduras poden atoparse aquí.^[22][24] Con todo, observáronse moitas contradicións de experimentos especiais coa teoría en ambientes complicados cando as orientacións e rendementos cuánticos das moléculas son difíciles de estimar.^[31]

En microscopia de fluorescencia, a microscopia de varrido láser confocal de fluorescencia, así como en bioloxía molecular, a FRET é unha útil ferramenta para cuantificar as dinámicas moleculares en biofísica e bioquímica, como as interaccións proteína-proteína, interaccións proteína-ADN e os cambios conformacionais nas proteínas. Para monitorizar a formación complexa entre dúas moléculas, unha delas é etiquetada cun doante e a outra cun aceptor. A eficiencia da FRET é medida e usada para identificar as interacción entre os complexos etiquetados. Hai varios xeitos de medir a eficiencia da FRET monitorizando os cambios na fluorescencia emitida polo doante e o aceptor.^[32]

Un método de medir a eficiencia da FRET é medir a variación na intensidade de emisión do aceptor.^[18] Cando o doante e o aceptor están próximos (a 1–10 nm) debido á interacción das dúas moléculas, increméntase a emisión do aceptor debido á FRET intermolecular desde o doante ao aceptor. Para monitorizar os cambios conformacionais de proteínas, etiquétase a proteína diana cun doante e un aceptor en dous loci. Cando un torcemento ou dobramento da proteína causa un cambio na distancia ou orientación relativa do doante e o aceptor, obsérvase un cambio na FRET. Se unha interacción molecular ou un cambio conformacional da proteína é dependente da unión do ligando, esta técnica de FRET é aplicable aos indicadores fluorescentes para a detección do ligando.

As eficiencias da FRET poden tamén inferirse a partir das taxas de fotobranqueamento do doante en presenza e ausencia dun aceptor.^[18] Ese método pode realizarse coa maioría dos microsocopios de fluorescencia; un destes microscopios simplemente fai brillar a luz de excitación (dunha frecuencia que excita o doante pero non o aceptor significativamente) sobre espécimes con e sen o fluoróforo aceptor e monitoriza a fluorescencia co paso do tempo do doante (tipicamente separada da fluorescencia do aceptor usando un filtro pasa-banda). A escala de tempo é a do fotobranqueamento, que é de segundos ou minutos, e a fluorescencia en cada curva vén dada por

${\displaystyle {\text{fondo}}+{\text{constante}}\cdot e^{-{\text{tempo}}/\tau _{\text{pb}}},}$

onde ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$ é a constante de tempo de decadencia do fotobranqueamento e depende de se o aceptor está presente ou non. Como o fotobranquemento consiste na inactivación permanente de fluoróforos excitados, a transferencia de enerxía de resonancia desde un doante excitado a un fluoróforo aceptor impide o fotobranqueamento dese fluoróforo doante, e así unha eficiencia de FRET alta orixina unha constante de tempo de decaimento de fotobranqueamento máis longa:

${\displaystyle E=1-\tau _{\text{pb}}/\tau _{\text{pb}}',}$

onde ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}'}$ e ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$ son as constantes de tempo de decaimento do fotobranqueamento do doante en presenza e en ausencia do aceptor, respectivamente. (Nótese que a fracción é a recíproca da usada para as medidas do tempo de vida).

Esta técnica foi introducida por Jovin en 1989.^[33] O seu uso dunha curva de puntos completa para extraer as constantes de tempo pode ter a vantaxe dunha maior exactitude que os outros métodos. Ademais, o feito de que os tempos de medida sexan da orde de segundos en vez de nanosegundos fai máis fácil as medidas de tempo de vida de fluorescencia, e como as taxas de decaimento do fotobranqueamento non dependen xeralmente da concentración de doantes (a non ser que a saturación de aceptor sexa un problema), non é necesario o coidadoso control das concentracións necesarias para as medidas de intensidade. Porén, é importante manter a mesma iluminación para as medidas con e sen aceptor, xa que o fotobranqueamento se incrementa marcadamente con luz incidente máis intensa.

A eficiencia da FRET pode tamén ser determinada a partir do cambio no tempo de vida da fluorescencia do doante.^[18] O tempo de vida do doante diminuirá na presenza do aceptor. As medidas do tempo de vida da FRET-doante utilízanse na microscopia de imaxes de tempo de vida de fluorescencia (FLIM, do inglés fluorescence-lifetime imaging microscopy).

A smFRET (single-molecule FRET) é un grupo de métodos que usa varias técnicas de microscopia para medir un par de fluoróforos doante e aceptor que son excitados e detectados ao nivel dunha soa molécula. En contraste coa "FRET conxunto" ou a "FRET en masa" que proporcionan o sinal de FRET dun alto número de moléculas, a FRET de molécula única pode resolver o sinal de FRET de cada molécula individual. As variacións do sinal da smFRET son útiles para revelar información cinética que un conxunto de medidas non pode proporcionar, especialmente cando o sistema está en equilibrio. Pode observarse tamén a heteroxeneidade entre diferentes moléculas. Este método foi aplicado en moitas medidas de dinámica biomolecular como o pregmento/despregamento do ADN/ARN/proteínas e outros cambios conformacionais, e a dinámica intermolecular como a reacción, unión, adsorción e desorción, que son especialmente útiles en detección química, bioensaios e biodetección.

Un par de fluoróforos común para usos biolóxicos é o formado pola proteína fluorescente ciano (CFP) e a proteína fluorescente amarela (YFP).^[34] Ambas son variantes de cor da proteína fluorescente verde (GFP). Para a etiquetaxe con tinguiduras fluorescentes cómpre a purificación, modificación química e inxección intracelular dunha proteína hóspede. O máis conveniente pode ser que as variantes da GFP se unan a unha proteína hóspede por enxeñaría xenética. Ademais, a fusión da CFP e a YFP ("dímero tándem") que quedan ligadas por unha secuencia de aminoácidos de corte recoñecida por unha protease, poden usarse nun ensaio de clivaxe proteolítico.^[35]

Unha limitación da FRET realizada con doantes fluoróforos é a necesidade dunha iluminación externa para iniciar a transferencia de fluorescencia, a cal pode orixinar un ruído de fondo nos resultados debido á excitación directa do aceptor ou ao fotobranqueamento. Para evitar este inconveniente, desenvolveuse a transferencia de enerxía de resonancia de bioluminescencia ou BRET polas súas siglas en inglés.^[36][37] Esta técnica usa unha luciferase bioluminescente (normalmente a luciferase de Renilla reniformis) en lugar da CFP para producir a emisión fotónica inicial compatible con YFP.

A BRET foi tamén aplicada usando outros encimas luciferase diferentes, obtidos por enxeñaría a partir do camarón de augas profundas Oplophorus gracilirostris. Esta luciferase é máis pequena (19 kD) e máis brillante que a luciferase de uso máis común de Renilla reniformis,^{[38][39][40][41]} e denominouse NanoLuc^[42] ou NanoKAZ.^[43] Promega desenvolveu un substrato patentado para NanoLuc chamado furimazine,^[44][42] aínda que se publicaron tamén outros valiosos substratos de coelenterazina para NanoLuc.^[43][45] Unha versión de proteína dividida de NanoLuc desenvolvida por Promega^[46] utilizouse tamén como doante da BRET en experimentos que miden as interaccións proteína-proteína.^[47]

En xeral, o termo "FRET" refírese a situacións nas que as proteínas (ou "fluoróforos") doantes e receptoras son de tipos diferentes. Porén, en moitas situacións biolóxicas pode haber a necesidade de examinar as interaccións entre dúas ou máis proteínas do mesmo tipo, ou incluso de moléculas da mesma proteína, por exemplo se a proteína sofre pregamento ou forma parte dunha cadea de proteínas polimérica,^[48] ou por outras cuestións de cuantificación en células biolóxicas^[49] ou experimentos in vitro.^[50]

Obviamente, as diferenzas espectrais non serán nestes casos a ferramenta usada para detectar e medir a FRET, xa que tanto a proteína aceptora coma a doante emiten luz da mesma lonxitude de onda. Aínda así poden detectarse as diferenzas na polarización entre a luz que excita os fluoróforos e a luz que é emitida, nunha técnica chamada imaxes de anisotropía de FRET; o nivel de anisotropía cuantificado (diferenza na polarización entre os feixes de excitación e emisión) convértese entón nunha guía indicativa de cantos eventos de FRET ocorreron.^[51]

No campo da nanofotónica, a FRET pode ser prexudicial se canaliza enerxía excitónica aos sitios defectuosos, mais é tamén esencial para cargar captación en células solares sensibilizadas de punto cuántico e orgánicas, e propuxéronse varias estratexias que permiten a FRET para diferentes aparellos optoelectrónicos. É entón esencial para comprender como se comportan os nanoemisores illados cando están empillados nunha capa densa. As nanoplaquiñas son candidatos especialmente prometedores para unha difusión excitón de homo-FRET forte debido ao seu forte acoplamento de dipolo en plano e baixo desprazamento de Stokes.^[52] O estudo con microscopia de fluorescencia de ditas cadeas individuais demostrou que a transferencia de enerxía por FRET entre plaquiñas veciñas causa que a enerxía difunda a unha lonxitude típica de 500 nm (aproximadamente 80 nanoemisores), e o tempo de transferencia entre plaquiñas é da orde de 1 ps.^[53]

Utilízanse varios compostos máis ademais das proteínas fluorescentes.^[54]

As aplicacións da transferencia de enerxái de resonancia (FRET) ampliáronse tremendamente nos últimos 25 anos, e a técnica converteuse en básica en moitos campos biolóxicos e biofísicos. A FRET pode usarse como unha regra espectroscópica para medir distancias e detectar interaccións moleculares en varios sistemas e ten aplicacións en bioloxía e bioquímica.^[30][55]

A FRET úsase a miúdo par detectar e rastrear interaccións entre proteínas.^{[56][57][58][59]} Adicionalmente, a FRET pode usarse para medir distancias entre dominios dunha mesma proteína etiquetando diferentes rexións da proteína con fluoróforos e medindo a emisión para determinar a distancia. Isto proporciona información sobre a conformación da proteína, incluíndo as estruturas secundarias e o pregamento das proteínas.^[60][61] Isto amplíase ao rastreo de cambios funcionais na estrutura da proteína, como os cambios conformacionais asociados coa actividade da miosina.^[62] Aplicada in vivo, a FRET foi usada para detectar a localización e interaccións de estruturas celulares como as integrinas e as proteínas de membrana.^[63]

A FRET pode usarse para obsevar a fluidez da membrana, o movemento e dispersión de proteínas de membrana, interaccións entre proteínas e lípidos de membrana e entre proteína e proteína, e a mestura de diferentes membranas.^[64] A FRET tamén se usou para estudar a formación e propiedades de dominios de membrana e balsas lipídicas en membranas celulares^[65] e para determinar a densidade de superficie en membranas.^[66]

As sondas baseadas en FRET poden detectar a presenza de varias moléculas: a estrutura da sonda é afectada pola unión ou actividade de pequenas moléculas, que pode acender ou apagar o sistema FRET. Isto utilízase a miúdo para detectar anións, catións, moléculas pequenas non cargadas e tamén algunhas biomacromoléculas máis grandes. De xeito similar, os sistemas FRET foron deseñados para detectar cambios no ambiente celular debido a factores tales como o pH, hipoxia ou potencial de membrana mitocondrial.^[67]

Outro uso da FRET é no estudo de vías de sinalización ou metabólicas.^[68] Por exemplo, a FRET e a BRET utilizáronse en varios experimentos para carcterizar a activación do receptor acoplado á proteína G e os consecuentes mecanismos de sinalización.^[69] Outros exemplos son o uso da FRET para analizar procesos tan diversos como a quimiotaxe bacteriana^[70] e a actividade da caspase na apoptose.^[71]

As dinámicas de pregamento de proteínas, ADNs, ARNs e outros polímeros medíronse utilizando a FRET. Usualmente, estes sistemas están nun equilibrio cuxa cinética está oculta. Porén, poden cuantificarse medindo con FRET de molécula única coas tinguiduras aceptora e doante na situación apropiada sobre as moléculas. Ver FRET de molécula única para unha descrición máis detallada.

Ademais dos usos comúns antes mencionados, a FRET e a BRET son tamén efectivas no estudo da cinética de reaccións bioquímicas.^[72] A FRET úsase cada vez máis para monitorizar a ensamblaxe e desensamblaxe dependentes do pH e é valiosa na análise da encapsulación de ácidos nucleicos.^{[73][74][75][76]} Esta técnica pode utilizarse para determinar factores que afectan varios tipos de formación de nanopartículas^[77][78] así como os mecanismos e efectos das nanomedicinas.^[79]

Un mecanismo diferente, pero relacionado, é a transferencia de electróns de Dexter.

Un método alternativo para detectar a proximidade entre proteínas é a complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), na cal cada unha de dúas partes dunha proteína fluorescente é fusionada con outras proteínas. Cando estas dúas partes se encontran, forman un fluoróforo nunha escala de tempo de minutos ou horas.^[80]

• Transferencia de electróns de Dexter
• Acoplamento de Förster
• Transferencia de enerxía de superficie
• Transferencia de enerxía de fluorescencia resolta no tempo

• FRET effect in a thin film no YouTube
• FRET Imaging (Tutorial do páxina web de Becker & Hickl)