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Le , le roi Sanche IV de Castille autorisa Gonzalo García Gudiel, archevêque de Tolède et chancelier du royaume, à instituer à Alcalá de Henares un Studium jouissant des mêmes privilèges que celui qui existait à Valladolid. Cependant, ce document est isolé, et on n'a ensuite souvenir d'aucun établissement important d'enseignement dans ce lieu avant 1459. Le de cette année-là, le pape Pie II, à la demande d'Alfonso Carrillo de Acuña, archevêque de Tolède, promulgua une bulle autorisant la création de trois chaires de grammaire et d'arts libéraux à Alcalá de Henares (dotées financièrement grâce à des bénéfices ecclésiastiques). La fondation du cardinal de Cisneros ne se fit donc pas entièrement ex nihilo (et d'ailleurs, né lui-même dans la région, il a peut-être fait ses premières études au Studium d'Alcalá). Mais jusqu'en 1499, ce ne fut pas un Studium generale (comme à Salamanque), mais un simple Studium particulare privilegiatum.
Par une bulle promulguée le à la requête du cardinal, le pape Alexandre VI autorisa la création d'un Studium generale prenant d'abord la forme du Collège de Saint Ildefonse (Colegio de San Ildefonso), que le cardinal avait conçu sur le modèle du Grand Collège de Saint Barthélemy (Colegio Mayor de San Bartolomé, ou Colegio Viejo) de l'université de Salamanque. Le supérieur de l'église collégiale des saints Just et Pasteur, instituée par l'archevêque Carrillo de Acuña (actuelle cathédrale d'Alcalá de Henares) avait le droit de promotion. Les diplômés devaient jouir des mêmes privilèges que ceux des Studia de Valladolid, Salamanque et Bologne. La première pierre du Collège fut posée le , et la première promotion d'étudiants fut accueillie le , jour de la saint Luc.
Cette université fut la première en Europe dont la fondation juridique fut suivie de la construction d'un véritable campus, à commencer par la construction du Colegio Mayor, dû à Pedro de Gumiel, architecte attitré du cardinal de Cisneros. L'ampleur de la conception de ce dernier se marque par l'expression Civitas Dei (« Cité de Dieu ») utilisée à l'époque pour désigner le nouvel établissement.
Le , le cardinal dota sa fondation des Constituciones del Colegio Mayor de San Ildefonso, y organisant toute la vie institutionnelle, bien plus centralisée et autoritaire qu'à Salamanque : le recteur, qui dans cette dernière université était un étudiant élu pour un an par une commission composée de professeurs et de délégués des étudiants, était à Alcalá nommé par l'archevêque de Tolède et doté de pouvoirs étendus. En 1513, le cardinal décida la fondation de six nouveaux collèges autour du Colegio Mayor : le Colegio de San Pedro y San Pablo (le seul lié à un ordre religieux, les Franciscains) ; le Colegio de la Madre de Dios (ou Colegio de los Teólogos) ; le Colegio de Santa Catalina (ou Colegio de los Físicos) ; le Colegio de Santa Balbina (ou Colegio de los Lógicos) ; le Colegio de San Eugenio et le Colegio de San Isidoro (Colegios de los Gramáticos, fusionnés au XVIIe siècle en un Colegio de San Ambrosio). Après la mort du cardinal en 1517 se fondèrent jusqu'au XVIIe siècle d'autres colegios menores (fondations des différents ordres religieux, ou fondations royales, ou fondations privées), si bien que leur nombre atteignit finalement une trentaine. Mais Alcalá resta toujours une université plus petite et plus « aristocratique » que Salamanque : environ 2 000 étudiants à son apogée (contre plus de 7 000 à Salamanque en 1584).
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