Il est né d'un père anglais, magistrat et administrateur de la Compagnie anglaise des Indes orientales et d'une mère écossaise. Quand il a 12 ans, ses parents l'envoient dans une grammar school (lycée) en Angleterre. À 16 ans, il s'engage dans l'armée du Bengale. La première guerre anglo-birmane éclate en 1824. Le jeune Brooke lève un corps de cavalerie formé de volontaires qu'il mena au combat. Il connut son baptême du feu à Rungpore en janvier 1825[1]. Il est blessé à sa première charge et rapatrié en Angleterre.
En 1830, il repart pour Madras mais arrive trop tard pour rejoindre l'armée. Il essaie alors de se lancer dans le commerce en Extrême-Orient, sans succès.
En 1835, son père meurt, lui léguant 30 000 livres, avec lesquelles il achète un bateau. Il met le cap sur Bornéo le après un long périple jusqu'à Singapour[2]. Après une première prise de contact avec les lieux et le souverain local, le Rajah Mudah Hassim, Brooke met le cap sur les Îles Célèbes et Singapour. Le retour à Bornéo se fait six mois plus tard[3]. Il arrive à Kuching, la capitale locale, en plein soulèvement des Dayak contre le sultan du Brunei. Il offre ses services au sultan et parvient à un règlement pacifique de l'affaire. Le sultan lui confère le titre de rajah (vice-roi) de Sarawak en gage de reconnaissance pour son implication dans la résolution du conflit.
Brooke entreprend alors de réformer l'administration du territoire, promulgue des lois et lutte contre la piraterie, un problème persistant tout le long de son gouvernement. Brooke rentre temporairement en Angleterre en 1847, où on le nomme gouverneur et commandant en chef de Labuan et consul général britannique à Bornéo. En 1851, Brooke est l'objet d'accusations de malversations. Une commission royale d'enquête est nommée à Singapour, qui conclut à l'absence de preuves.
Brooke gouverne le royaume de Sarawak jusqu'à sa mort en 1868. Son neveu, Charles Anthony Johnson Brooke, lui succède comme rajah.
James Brooke apparaît dans l'œuvre de l'écrivain Emilio Salgari, qui fait de lui l'un des principaux adversaires de son héros Sandokan surnommé « le Tigre de la Malaisie ». Dans la série télévisée franco-germano-italienne Sandokan de 1976, inspirée des romans de Salgari, le rôle de James Brooke est interprété par l'acteur italien Adolfo Celi.
James Brooke inspire certains tomes (dont Le trésor du Rajah Blanc) de la bande dessinée franco-belge Théodore Poussin de Frank Le Gall (1987-2005).