Il part en février 1541 de Quito et rejoint Gonzalo Pizarro pour une expédition dans l'intérieur du continent vers l'Eldorado et La Canela, à la recherche de la cannelle qui valait alors en Europe plus cher au poids que l'or. Ils franchissent les Andes, et atteignent le río Napo, après avoir perdu 140 des 220 Espagnols et 3 000 des 4 000 Indiens de l'expédition. N'ayant découvert que des faux canneliers, Gonzalo Pizarro fait brûler et dévorer par ses chiens ses guides indiens. Ils se séparent le : Pizarro retourne à Quito, mais Orellana continue.
Il fait construire d'abord le San Pedro, un petit brigantin, pour transporter les malades et les blessés, puis change d'idée, et fait construire un autre brigantin, le Victoria, avec lequel il entame la descente de la rivière, avec 57 hommes. Effectuant un voyage des plus risqués, Orellana parvient à partir du Río Napo à la rivière Trinidad et l'Amazone, dont il découvre l'embouchure après 4 800 km de parcours. Ils s'y arrêtent (île de Marajó) pour réparer, et rejoignent Nueva Cádiz sur l'île de Cubagua le .
Il reçoit des lettres patentes de Charles Quint pour établir des colonies à l'embouchure du fleuve le . Il épouse une jeune fille pauvre, Ana de Ayala, et repart le avec trois vaisseaux. Il en perd un au cours de la traversée, et abandonne l'autre en arrivant. Il meurt d'une flèche empoisonnée lors d'un combat avec les Indiens Caraïbes. Les rares survivants, dont sa femme, furent secourus par l'équipage du troisième navire, arrivé en retard. Lope de Aguirre prit le commandement. La plupart des survivants s'installèrent en Amérique.
Son expédition sur l'Amazone est à l'origine du nom du fleuve et de la légende de l'El Dorado. Le père Gaspar de Carvajal, missionnaire à Lima (et frère de Francisco de Carvajal, compagnon de Francisco Pizarro), chroniqueur de Orellana, rapporta qu'ils avaient été attaqués, le , par de farouches guerrières : il est possible toutefois que ces ennemis fussent des Amérindiens portant les cheveux longs. C'est ainsi que l'Amazone reçut le nom qui lui est resté (originellement rio de las Amazonas, « rivière des Amazones »).
Anthony Smith, Explorers of the Amazon, London, England ; New York, N.Y., Viking, 1990. (OCLC20720333)
Gaspar de Carvajal, Relación del nuevo descubrimiento del famoso río Grande que descubrió por muy gran ventura el capitán Francisco de Orellana. (OCLC66267745)
Jean-Marie Warêgne, Francisco de Orellana Découvreur de l'Amazone, L'Harmattan, Paris, 2014, (ISBN978-2-343-02742-5)
Buddy Levy, La rivière des ténèbres : Voyage légendaire le long de l'Amazone, Paulsen, , 349 p. (ISBN978-2-37502-159-0)
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