De Winne valmistui Belgian kuninkaallisesta kadettikoulusta vuonna 1979. Vuonna 1984 hän valmistui Kuninkaallisesta sotilasakatemiasta Brysselistä tietotekniikan ja rakennustekniikan maisterintutkinnolla. Valmistuttuaan ilmavoimien lentokoulusta hän lensi Dassault Mirage 5:tä ilmavoimissa, minkä jälkeen hän työskenteli SAGEMille Pariisissa Miragen lentoturvallisuuden parissa. Vuonna 1992 De Winne valmistui koelentäjäksi Empire Test Pilots Schoolista (ETPS) Boscombe Downin koelentäjäkoulusta Britanniassa saaden myös koulun vuoden parhaan lentäjäoppilaan palkinnon, McKenna Trophyn. Valmistumisen jälkeen hän toimi Belgian ilmavoimien koelentäjänä ja lentoturvallisuudesta vastaavana, myöhemmin vanhempana koelentäjänä vastaten kaikista testiohjelmista.
12. helmikuuta 1997 De Winnen ohjaama F-16 Fighting Falcon sai moottorivian tiheästi asutun alueen yllä Leeuwardenin lähellä. Koneen tietokoneen kaaduttua hän pystyi kuitenkin laskeutumaan hollantilaiseen lentotukikohtaan, minkä johdosta hänelle myönnettiin ainoana ei-amerikkalaisena Joe Bill Dryden Semper Viper Award.[3]
Elokuussa 1998 De Winnestä tuli Kleine Brogelista operoivan 349 Squadronin komentaja. NATOn pommittaessa Jugoslaviaa 1998 De Winne komensi hollantilais-belgialaista lento-osastoa.
De Winnellä on yli 2 300 lentotuntia Miragella, F-16:lla, Tornadolla ja Jaguarilla. Hän toimii myös Belgian armeijan lentohenkilöstön järjestön puheenjohtajana.
De Winnen ensimmäinen avaruuslento (30. lokakuuta – 10. marraskuuta 2002) oli lentoinsinöörinä Kansainväliselle avaruusasemalle (ISS) vuonna 2002. Lähtö asemalle tapahtui Sojuz TMA-1:lla ja paluu Sojuz TM-34:lla. Avaruudessaoloaikanaan De Winne suoritti menestyksekkäästi 23 tieteellistä koetta.
20. syyskuuta 2007 ESA ilmoitti De Winnen osallistuvan kuusikuukautiselle ISS-lennolle vuonna 2009.[5][6] 21. marraskuuta 2008 NASA ilmoitti muutoksista retkikunnan aikatauluun De Winnen tullessa Retkikunta 21:n komentajaksi.[7] 27. toukokuuta 2009 De Winne laukaistiin lennolla Sojuz TMA-15 ISS:lle ja hänestä tuli ensimmäinen ESAn astronautti, joka johti avaruustehtävää ("space mission").[7] De Winne laskeutui Maahan 1. joulukuuta 2009 Sojuz TMA-15:n mukana.
De Winne on saanut lukuisia kunnianosoituksia ja palkintoja. 20. joulukuuta 2002 Frank De Winne sai varakreivin arvonimen toiminnastaan avaruusohjelmassa. De Winne on naimisissa Lena Clarken kanssa. De Winnellä on kolme lasta aikaisemmasta avioliitosta.
