CRISPR

E. colin Cas-proteiini (sinisellä) kiinni yksijuosteisessa DNA:ssa (oranssilla).

CRISPR eli clustered regularly-interspaced short palindromic repeats ovat DNA-jaksoja, jotka muodostavat useiden bakteerien ja arkkien alkeellisen immuunipuolustuksen arkki- ja bakteeriviruksia vastaan. Näihin jaksoihin ja Cas-proteiineihin (CRISPR associated protein) pohjautuvia geenimuuntelutekniikoita on kehitetty, esimerkiksi CRISPR/Cas9-menetelmä.[1]

CRISPR-systeemejä on useita, mutta kukin koostuu mm. nukleaaseina (DNA:ta pilkkovina proteiineina) toimivia Cas-proteiineja koodaavasta cas-sekvenssistä ja "muistina" toimivasta CRISPR-sekvenssistä, jota käytetään bakteerivirusten eli bakteriofagien vieraan perimän tunnistukseen ja tallettamiseen. Cas1 ja Cas2 ovat kaikissa luonnosta löydetyissä systeemeissä läsnä.[2]

CRISPR-termi on englanninkielinen lyhenne. Infektion tunnistavat sekvenssit ovat bakteerin (tai arkin) DNA:ssa ryppäytyneesti tasaisin välimatkoin toisistaan (CRI). Bakteerit ottavat tunnistussekvensseihin vain osan viruksen perimästä. Tunnistussekvenssit erottavat toisistaan lyhyet palindromiset toistosekvenssit (SPR)[2], jotka eivät ole peräisin viruksen genomista.

CRISPR-Cas9 geenin muokkaustekniikka oli merkittävässä asemassa Emmanuelle Charpentierille ja Jennifer Doudnalle vuonna 2020 myönnetyssä Nobelin kemianpalkinnosta

Toiminta luonnossa

Aiemmin kohdatun viruksen tunnistus[3]

Yleisluontoinen kuva prokaryoottien CRISPR-systeemistä.[3]

1. Kun bakteeriin (tai arkkiin) tuodaan viruksen DNA:ta, jolle bakteeri on jo immuuni, tuottaa bakteeri Cas-proteiinin ja CRISPR-sekvenssin alueelta aiemmin talletetun crRNA:n (CRISPR RNA). crRNA sisältää sekvenssin, joka on komplementaarinen eli emäksiltään yhteensopiva lyhyeen sekvenssiin viruksen DNA:ssa.

2. Cas ja crRNA muodostavat kompleksin.

3. Kompleksi sitoo viruksen DNA:n crRNA:n komplementaarisen sekvenssin avulla.

4. Cas pilkkoo viruksen DNA:n toimimattomaksi ja estää siten viruksen monistumisen ja bakteerin infektoitumisen.

Uuden viruksen tunnistus[3]

1. Kun bakteeriin (tai arkkiin) tuodaan viruksen DNA:ta, jolle bakteeri ei ole immuuni, bakteeri tuottaa Cas1-nukleaasin.

2. Cas1 sitoo jonkin sekvenssin viruksen DNA:sta ja pilkkoo sen sopivan pituiseksi pätkäksi.

3. Pätkä liitetään CRISPR-alueeseen bakteerin DNA:han pysyvästi. Tällöin bakteeri "muistaa" infektion ja voi puolustautua sitä vastaan.

Käyttö geenimuuntelussa

Esimerkiksi CRISPR/Cas9-systeemi on geenimuuntelutekniikka, johon sisältyy yksinkertaisimmillaan vain Cas9-proteiini, Cas9:n ohjaukseen käytetty RNA-pätkä ja muuntelun kohteena oleva DNA. Tekniikka toimii elävissä soluissa. Muunteluun osallistuvat komponentit voidaan pistää soluun sisälle mikroskooppisen ohuella injektioneulalla.[4]

Tekniikassa luonnossa normaalisti erillään olevista tracrRNA:sta (trans-activating crRNA) ja crRNA:sta on tuotettu kimeeri, yhtenäinen RNA-ohjausjakso. Kimeeriä kutsutaan sgRNA:ksi (single guide RNA) ja se muodostetaan, jotta muuntelussa on vähemmän osallistuvia RNA:ita (kahden sijaan yksi). sgRNA voidaan tuottaa synteettisesti.[4]

Luonnossa tracrRNA:n tehtävänä on pitää crRNA:ta paikallaan Cas9:ssä crRNA:n kanssa komplementaarisen sekvenssinsä kanssa. crRNA:ssa puolestaan on normaalisti viruksen tunnistukseen käytetty sekvenssi, mutta sekvenssi on korvattu sgRNA:ssa muuntelun kohteena olevan DNA:n tietyn alueen kanssa komplementaariseksi.[4]

Cas9-nukleaasi ohjautuu sgRNA:ssa olevan RNA-sekvenssin avulla tiettyyn kohtaan DNA:ssa, tämän kanssa komplementaariseen sekvenssiin. Oikeassa kohdassa ollessaan Cas9 leikkaa DNA:n tietystä kohtaa. Tätä voidaan käyttää ns. knock-out muunteluun, jossa tarkastellaan geenien poiston eli inaktivaation vaikutusta soluun tai suurempaankin eliöön. Solu pyrkii korjaamaan katkoksen ja liittämään DNA-pätkät yhteen. Vaihtoehtoisesti katkokseen voidaan useimmiten liittää eli insertoida halutunlainen geeni.[4]

CRISPR/Cas9-menetelmässä täytyy periaatteessa vain ensin selvittää geenimuuntelun kohteena olevan DNA:n sekvenssi sekvensoimalla.

Moniin muihin geenimuuntelutekniikoihin verrattuna CRISPR/cas9 on äärimmäisen tarkka, laajalti sovellettavissa, halpa ja yksinkertainen käyttää. Tekniikka on 2010-luvusta lähtien mullistanut geenimuuntelua ja geenitutkimusta suuresti:[5][6] se esimerkiksi teki geeniajureiden käytön mahdolliseksi.[7]

Lähteet

  1. ↑ Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE: A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLoS Computational Biology, November 2005, 1. vsk, nro 6, s. e60. PubMed:16292354 PubMed Central:1282333 doi:10.1371/journal.pcbi.0010060 Bibcode:2005PLSCB...1...60H
  2. ↑ a b Nuñez JK, Kranzusch PJ, Noeske J, Wright AV, Davies CW, Doudna JA: Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nature Structural & Molecular Biology, 2014, 21. vsk, nro 6, s. 528–534. PubMed:24793649 PubMed Central:4075942 doi:10.1038/nsmb.2820
  3. ↑ a b c Horvath P, Barrangou R: CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science (New York, N.Y.), 2010, 327. vsk, nro 5962, s. 167–170. PubMed:20056882 doi:10.1126/science.1179555
  4. ↑ a b c d Kelley ML, Strezoska Ž, He K, Vermeulen A, Smith Av: Versatility of chemically synthesized guide RNAs for CRISPR-Cas9 genome editing. Journal of Biotechnology, 2016, 233. vsk, s. 74–83. PubMed:27374403 doi:10.1016/j.jbiotec.2016.06.011
  5. ↑ Biologists create more precise molecular scissors for genome editing nature.com. Viitattu 4.12.2016.
  6. ↑ Snyder, Bill: New technique accelerates genome editing process 21.8.2014. Vanderbilt University. Viitattu 4.12.2016.
  7. ↑ Wartiovaara, Kimmo: Ihmiskunnan DNA : Elämän koodin kirjoitus, s. 129–131. Tallinna: Duodecim, 2022. ISBN 978-952-360-079-9.

Aiheesta muualla

Wikimedia Commonsissa on kuvia tai muita tiedostoja aiheesta CRISPR.