Urkil txikiko RNA

Urkil txikiko RNA edo shRNA (ingelesez short hairping RNA) urkila forma duen RNA molekula txiki eta artifizial bat da. Bere funtzioari dagokionez, itu-genearen adierazpena RNA interferentzia bidez isilarazteko balio du.[1][2] Horrela, gene horrek kodetzen duen proteinaren funtzioa azter daiteke, bide biologikoak karakterizatuz eta gene eta proteinen arteko elkarrekintzak identifikatuz.  

Zeluletan shRNAren adierazpena emateko, bertara garraiatu behar da eta hau plasmido edo bektore biriko edo bakterianoen bidez egin daiteke. shRNA RNA interferente (iRNA) mota abantailatsu bat da, degradazio- eta ordezkapen-tasa nahiko txikia duena. [3] Horregatik eta beste hainbat arrazoiengatik, shRNA etorkizunerako agente terapeutiko eraginkor bat izan daitekeela uste da. Hala ere, funtzionala izateko adierazpen-bektore baten beharra du eta honek aplikazio terapeutikoetan albo-ondorioak izan ditzake.[4]

Garraioa

Zeluletako shRNAren adierazpena plasmido edo bektore biriko edo bakterianoen garraio bidez lor daiteke. Plasmido bidezko shRNAren transferentziarako, merkatuan in vitro dauden erreaktiboak erabil daitezke. Hala ere, metodo hori ez da aplikagarria in vivo eta beraz, erabilera mugatua du.

Bektore bakterianoen erabilera nahiko ikuspegi berria da. Ikerketa batean saguak shRNA txertatuta duen plasmidoa garraiatzen duen Escherichia coli birkonbinatuz elikatu ziren. Horrela, heste-epitelioko itu-genearen adierazpen genikoa eteten zela ikusi zen.[5]

Bektore biriko mota bat baino gehiago erabil daiteke zeluletako shRNA adierazpena lortzeko, adenobirusak, hauei lotutako birusak (ingelesez adeno-associated viruses edo AAVak) eta lentibirusak esaterako. Lehenengo biei dagokienez, genomak ez dira ostalariaren informazio genetikoan txertatuko. Infekzio egoera arrunt batean, birusak bere genoma ostalariarenean txertatu ohi du eta horrela ostalariaren makineria zelularra erabiliz bere burua hainbat aldiz kopiatuko du. Ez txertatze hori onuragarria izan daiteke, ostalariaren genomaren aldaketa ekiditen delako. Hala ere, badu bere desabantaila ere, zelularen progeniak berehala galduko baitu garraiatutako birusaren genoma zelula-zatiketaren bidez, zelula oso mantso zatitzen ez bada behintzat. AAVak, adenobirusekin alderatuz, gene birikoak ezabatu eta haien paketatze-ahalmena murrizten dute. Lentibirusetan transkripzio bidez aktibatzen den kromatinaren eskualdean integratzen da eta beraz, ondorengo zeluletara transmititzen dira.[6]

Jarduera

Lentibirus bidezko shRNAaren garraioa ugaztun-zeluletara eta bertan gertatzen den interferentzia-mekanismoa.

Bektorea ostalarian integratu ondoren, nukleoan II edo III RNA polimerasak shRNA  transkribatzen du, sustatzailearen arabera. Sustatzailearen aukeraketa egokia funtsezkoa da shRNAren adierazpen sendoa lortzeko. Hasiera batean, III polimerasaren sustatzaileak erabiltzen ziren baina hauek espazio- eta denbora-kontrolik ez dutela ikusi zen. [3] Beraz, azken urteetan II polimerasaren sustatzaileen erabilera sustatu da, hauek egokiagoak baitira shRNAren adierazpena erregulatzeko.

Transkripzio-produktua Drosha erribonukleasak prozesatzen du, RNA hidrolizatuz zati txikiagotan. Lortutako pre-shRNA, exportina batek nukleotik kanporatuko du. Ondoren, produktu hori Dicer erribonukleasak prozesatu eta RISC konplexuan (ingelesez RNA-induced silencing complex) kargatzen da. Itu-genearen harizpietako bat, kate atzeratua (5’-3’ noranzkoduna), degradatu egiten da eta besteak, kate gidariak (3’-5’ noranzkoduna), RISC konplexua mRNAra zuzentzen du, bere sekuentzia osagarria duena. Guztiz osagarriak badira, RISC konplexuak mRNA apurtuko du. Aldiz, osagarritasun partziala badago, RISC konplexuak mRNAren itzulpena erreprimituko du. Bi kasuetan, shRNAk itu-genea isilarazten du.[7]

Erabilera terapia genikoan

shRNAn oinarritutako terapiak erronka ugari ditu oraindik. Adierazgarriena, terapia genikoko beste metodo batzuekin gertatzen den bezala, garraio mekanismoa da. shRNA bektore baten bidez txertatzen da normalean, eta oro har metodo eraginkorra den arren, zalantza handiak sortzen ditu bere segurtasunari buruz.[8] Zehazki, ikerketa klinikoetan frogatu da birusetan oinarritutako terapia genikoko metodoak arriskutsuak izan daitezkeela. Terapia geniko erretrobiralaren lehen belaunaldian, bektore biralekin tratatutako Wiskott-Aldrich sindromeko gaixo batzuek leuzemia akutua garatu zuten, bektore bat txertatzearen ondorioz. [9]

RISC konplexu molekularra gain asetzea ere arazo bat da. Izan ere, shRNA maila altuegietan adieraziz gero, posible da zelula RNA endogenoa (ostalariaren RNA) behar bezala prozesatzeko gai ez izatea eta horrek arazo larriak sor ditzake. Beste erronka bat pazienteak terapiaren aurkako erantzun immunea garatzeko aukera da, arrotza den RNA molekula bat baita administratzen dena. [10] Azkenik, zaila den arren, shRNAak beste gene batzuk isilaraz ditzake nahi gabe. Beraz, shRNAn oinarritutako terapia geniko berri bat arrakastaz garatzeko, erronka horiek guztiak hartu behar dira kontuan.

Hala ere, shRNAk errepresio geniko oso espezifiko eta iraunkorra emateko duen trebetasunaren ondorioz, interes handia garatu da terapia genikoan shRNA erabiltzeko.

Erreferentziak

  1. ↑ Paddison, Patrick J.; Caudy, Amy A.; Bernstein, Emily; Hannon, Gregory J.; Conklin, Douglas S.. (2002-04-15). «Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells» Genes & Development 16 (8): 948–958.  doi:10.1101/gad.981002. ISSN 0890-9369. PMID 11959843. PMC PMC152352. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  2. ↑ Brummelkamp, Thijn R.; Bernards, René; Agami, Reuven. (2002-04-19). «A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells» Science (New York, N.Y.) 296 (5567): 550–553.  doi:10.1126/science.1068999. ISSN 1095-9203. PMID 11910072. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  3. ↑ Moore, Chris B.; Guthrie, Elizabeth H.; Huang, Max Tze-Han; Taxman, Debra J.. (2010). «Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown» Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 629: 141–158.  doi:10.1007/978-1-60761-657-3_10. ISSN 1940-6029. PMID 20387148. PMC 3679364. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  4. ↑ Wang, Zhaohui; Rao, Donald D.; Senzer, Neil; Nemunaitis, John. (2011-12). «RNA interference and cancer therapy» Pharmaceutical Research 28 (12): 2983–2995.  doi:10.1007/s11095-011-0604-5. ISSN 1573-904X. PMID 22009588. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  5. ↑ Xiang, Shuanglin; Fruehauf, Johannes; Li, Chiang J.. (2006-06). «Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals» Nature Biotechnology 24 (6): 697–702.  doi:10.1038/nbt1211. ISSN 1087-0156. PMID 16699500. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  6. ↑ Lombardo, Angelo; Genovese, Pietro; Beausejour, Christian M.; Colleoni, Silvia; Lee, Ya-Li; Kim, Kenneth A.; Ando, Dale; Urnov, Fyodor D. et al.. (2007-11). «Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery» Nature Biotechnology 25 (11): 1298–1306.  doi:10.1038/nbt1353. ISSN 1087-0156. PMID 17965707. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  7. ↑ «shRNA - Applications - What is shRNA, how it works and its applications.» horizondiscovery.com (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  8. ↑ Bofill-De Ros, Xavier; Gu, Shuo. (2016-07-01). «Guidelines for the optimal design of miRNA-based shRNAs» Methods (San Diego, Calif.) 103: 157–166.  doi:10.1016/j.ymeth.2016.04.003. ISSN 1095-9130. PMID 27083402. PMC 4921303. (Noiz kontsultatua: 2022-03-22).
  9. ↑ Persons, Derek A.; Baum, Christopher. (2011-02). «Solving the problem of γ-retroviral vectors containing long terminal repeats» Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy 19 (2): 229–231.  doi:10.1038/mt.2010.305. ISSN 1525-0024. PMID 21289636. PMC 3034864. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).
  10. ↑ Whitehead, Kathryn A.; Dahlman, James E.; Langer, Robert S.; Anderson, Daniel G.. (2011). «Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system» Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering 2: 77–96.  doi:10.1146/annurev-chembioeng-061010-114133. ISSN 1947-5438. PMID 22432611. (Noiz kontsultatua: 2022-03-15).

Kanpo estekak