TaqMan

TaqMan zundak PCR kuantitatiboaren (qPCR) espezifikotasuna emendatzeko diseinatutako hidrolisi-zundak dira. Metodo hau Cetus Corporation-ko ikertzaileek 1991ean deskribatu zuten lehen aldiz [1] eta geroago Roche Molecular Diagnostics eta Applied Biosystems empresek garatu zuten, proba diagnostikoetarako eta ikerketarako hurrenez hurren.

TaqMan zundak Taq polimerasaren 5´-3´ exonukleasa aktibitatean oinarritzen dira. Zundak itu-sekuentziara hibridatuko dira eta eszisioak fluoreszentzia igorriko du [2]. Modu honetan, beste qPCR metodoetan antzera, polimerasaren kate-erreakzioaren (PCR) zikloetan metatutako produktuaren neurri kuantitatiboa eskuratuko da.Taqman zunden abantailarik nagusia detekzioaren espezifikotasuna nabarmen emendatzen dela da.

Hortaz, qPCRaren termozikladorean detektatutako fluoreszentzia askatutako fluoroforoarekiko eta DNA moldearen kantitatearekiko zuzenki proportzionala da. Metodo espezifiko honen helburua geneak kuantifikatzea da.

Oinarriak

1. irudia: TaqMan zunda baten mekanismoa.

TaqMan zunda oligonukleotido baten 5 'muturrari kobalenteki lotutako fluoroforoak eta 3' muturrean fluoreszentzia-desaktibatzaile batek (quencher) osatzen dute [3] (1. irudia).

Metodo honetan, hainbat fluoroforo (adib: 6-karboxifluoriszeina, tetrafluoriszeina) [1] eta quencher (adib: tetrametilrodamina) erabili daitezke. Quencherrak fluoroforoaren fluoreszentzia inhibitzen du, termozikladoreko argi iturriak kitzikatzen duenean. [1] Gauzak horrela, fluoroforoa eta quencherra elkarrengandik hurbil dauden bitartean ez da seinale fluoreszenterik egongo, quencherrak bere jarduera inhibitzailea burutzen egongo baita (1. irudia).

TaqMan zunda bakoitza oligonukleotido espezifiko pare batek anplifikatuko duen DNA eskualde espezifiko batekin hibridatzeko diseinatuta dago. Taq polimerasak katea 5’-3’ norabidean sintetizatzen duen heinean (molde gisa 3’-5’ noranzkoko katea erabiliz), entzima beraren 5’-3’ exonukleasa jardueraz baliatuz, jada DNAn hibridatutako TaqMan zunda degradatzen du. Zundaren degradazioak fluoroforoa banatzea eragiten du, honen eta quencherraren arteko hurbiltasuna hautsiz eta fluoreszentzia isurtzea ahalbidetuz. Detektatutako fluoreszentzia zuzenki proportzionala da askatutako fluoroforo kantitatearekiko eta modu beran PCR produktuaren intereseko DNA kantitarearekiko.

Aplikazioak

Taqman zundetan oinarritutako qPCR saioak ikerketan eta laborategi klinikoetan helburu ezberdinekin erabiltzen dira:

  • Adierazpen genikoaren inguruko saioak
  • Farmakogenomika
  • Giza-leukozitoen antigenoen (HLA) genotipadoa
  • Lagin klinikoetan karga birala zehaztea (VIH, Hepatitisa)
  • Bakterioak identifikatzeko saioak [4]
  • SNP genotipadoak
  • Microarrays deritzenen emaitzak baieztatzea

Erreferentziak

  1. ↑ a b c Holland, P M; Abramson, R D; Watson, R; Gelfand, D H. (1991-08-15). «Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.» Proceedings of the National Academy of Sciences 88 (16): 7276–7280.  doi:10.1073/pnas.88.16.7276. ISSN 0027-8424. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  2. ↑ «Figure 2—source data 3. List of TaqMan® gene expression assays.» dx.doi.org (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  3. ↑ «Supplementary file 1.» dx.doi.org (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
  4. ↑ Liu, Rongrong; Xing, Bengang. (2010-01). «Gold nanoparticles based colorimetric assay for bacterial enzyme identification and inhibitors screening» 2010 3rd International Nanoelectronics Conference (INEC) (IEEE)  doi:10.1109/inec.2010.5424738. (Noiz kontsultatua: 2022-03-30).
Aipuaren errorea: <ref> tag in <references> has conflicting group attribute "oh".

Kanpo estekak