EcoRI

EcoRI-ren egitura kristalinoa. DNAra lotutako dimeroa.

EcoRI Escherichia coli espezietik isolatutako murrizketa-entzima da. Izendatzeko modu egokia “Eco erre 1” da. Endonukleasa horrek DNAren helize bikoitza gune espezifikoetan zatitzen du, gainera, errestrikzio-modifikazio sistemaren parte da. Entzimaren izenari dagokionez, “E”-k jatorrizko espeziearen izenari egiten dio erreferentzia: Escherichia, “co” espeziearen izenari: coli, “R”-k andui zehatza adierazten du, RY13 kasu honetan, eta “I”-k andui horretatik isolatutako lehen entzima izan zela.

Biologia molekularrean murrizketa-entzima gisa erabiltzen da. EcoRI–k 5’ muturretan 4 nukleotidozko mutur itsaskorrak eratzen ditu: AATT. Entzimak ezagutuko duen DNA-ren itu-sekuentzia G↓AATTC sekuentzia palindromikoa da, CTTAA↓G -ren osagarria. Beste murrizketa-entzima batzuk haien itu-sekuentziaren arabera, 3’ muturretan mutur kamutsak eratu ditzazkete, edo mutur kamutsak.

Egitura

Egitura primarioa

EcoRI-ren itu sekuentzia. Entzimak egiten duen mozketa marra berdeaz adierazita.

EcoRI, hainbat errestrikzio endonukleasa bezala, PD..D/EXK motiboa du gune aktiboan.

Egitura sekundarioa eta tertziarioa

Entzima 31kDa-eko azpiunitate bakarreko homodimeroa da, α/β domeinu globularrean oinarritzen dena. Azpiunitate bakoitzak domeinu globularretik irteten den begizta bat du eta DNArekin lotzen denean katearen inguruan biltzen da.[1][2]

EcoRI kokristalizatua izan da mozten duen sekuentziarekin. Kristala konplexuaren (1QPS) egitura konpontzeko erabili da. Egitura kristalinoa, entzima homodimeroaren azpiunitateak DNArekin simetrikoki eragiten dutela erakusten du.[1] Konplexuan, azpiunitate bakoitzeko bi α helizeak elkartzen dira lau helizeko sorta eratzeko.[3] Interakzionatzen duten helizeetan Glu144 eta Arg145 hondarrak daude, elkarrekin eragiten dutenak, “crosstalk” eraztuna sortuz eta entzimaren bi gune aktiboak komunikatuz.[4]

Erabilerak

Murrizketa-entzimak ingeniaritza genetikoaren teknika askotan erabiltzen dira, adibidez,  klonazioan, DNAren sekzioen ebaketak in vitro-n… DNAren mutur itsaskorrak sortzen dituzten murrizketa-entzimak, EcoRI kasu, askotan erabiltzen dira loturaren aurretik DNA mozteko, mutur itsaskorrek lotura-erreakzio eraginkorragoa egiten baitute.[5] Erabilera horren adibide bat DNA birkonbinatua da, gene emailearen eta bektorearen arteko txertaketa ematen denean. [6]Erreakzioaren baldintzak direla eta, EcoRI errestrikzio-entzimak mozketa ez-ezpezifikoak egin ditzake (star aktibitatea). Star aktibitatea eragin dezaketen zenbait baldintza honako hauek dira: gatz kontzentrazio txikia, glizerol kontzentrazio altua, erreakzioan dauden entzima gehiegi, pH altua eta zenbait disolbatzaile organikoen kutsadura.[7]

Erreferentziak

  1. ↑ a b Pingoud, A.. (2001-09-15). «Structure and function of type II restriction endonucleases» Nucleic Acids Research 29 (18): 3705–3727.  doi:10.1093/nar/29.18.3705. PMID 11557805. PMC PMC55916. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  2. ↑ (Ingelesez) Kurpiewski, Michael R.; Engler, Lisa E.; Wozniak, Lucyna A.; Kobylanska, Anna; Koziolkiewicz, Maria; Stec, Wojciech J.; Jen-Jacobson, Linda. (2004-10). «Mechanisms of Coupling between DNA Recognition Specificity and Catalysis in EcoRI Endonuclease» Structure 12 (10): 1775–1788.  doi:10.1016/j.str.2004.07.016. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  3. ↑ Bitinaite, J.; Wah, D. A.; Aggarwal, A. K.; Schildkraut, I.. (1998-09-01). «FokI dimerization is required for DNA cleavage» Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95 (18): 10570–10575.  doi:10.1073/pnas.95.18.10570. ISSN 0027-8424. PMID 9724744. PMC PMC27935. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  4. ↑ (Ingelesez) Kim, Youngchang; Grable, John C.; Love, Robert; Greene, Patricia J.; Rosenberg, John M.. (1990-09-14). «Refinement of Eco RI Endonuclease Crystal Structure: A Revised Protein Chain Tracing» Science 249 (4974): 1307–1309.  doi:10.1126/science.2399465. ISSN 0036-8075. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  5. ↑ «Increasing Overhang GC-Content Increases Sticky-End Ligation Efficiency | jemi.microbiology.ubc.ca» ujemi.microbiology.ubc.ca (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  6. ↑ An introduction to genetic analysis. (7th ed. argitaraldia) W.H. Freeman 2000 ISBN 0-7167-3520-2. PMC 42049331. (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).
  7. ↑ «FAQs for EcoRI, Restriction Endonucleases, NEB» web.archive.org 2012-10-15 (Noiz kontsultatua: 2022-03-31).

Kanpo estekak