En 2003, fue elegida concejal del Ayuntamiento de Madrid y nombrada segunda teniente de alcalde, ocupándose de la Concejalía de Gobierno de Empleo y Servicios a la Ciudadanía hasta 2007. Desde 2004 formó parte del Comité de Dirección del Partido Popular de Madrid. Fue secretaria ejecutiva de Acción Social hasta 2008 y, desde entonces, secretaria ejecutiva de Acción Sectorial.
En las elecciones de 2007 fue la número dos en la lista del Partido Popular nuevamente para el Ayuntamiento de Madrid y ocupó la Concejalía de Medio Ambiente. Fue miembro del Comité Ejecutivo Nacional del Partido Popular desde 2008 hasta el congreso celebrado el 11 de febrero de 2017 donde fue cesada.[6] En enero de 2011, en calidad de concejal de Medio Ambiente del Ayuntamiento de Madrid, admitió que la ciudad no cumplía los baremos máximos de contaminación marcados por la Unión Europea.[14]
En junio de 2011 fue ratificada como segunda teniente de alcalde y titular del área de Gobierno de Medio Ambiente y Movilidad.[15]
El alcalde Alberto Ruiz-Gallardón abandonó la alcaldía de Madrid el 22 de diciembre de 2011 y al ser designado ministro de Justicia por el presidente del Gobierno, Mariano Rajoy. El 27 de diciembre, el pleno del Ayuntamiento eligió (con 31 votos de 55) a Ana Botella como alcaldesa de Madrid:[16][17] siendo la primera mujer que accedía a la alcaldía de la ciudad de Madrid.
En la presentación final de la Candidatura de Madrid 2020 en Buenos Aires, en septiembre de 2013, participó en la delegación española, mostrando en sus comunicaciones con periodistas un limitado conocimiento de la lengua inglesa.[18] Fue entonces cuando pronunció su frase más célebre: A relaxing cup of café con leche in Plaza Mayor, lo cual ocasionó numerosas bromas en los medios de comunicación y la sociedad española. Posteriormente Botella bromeó sobre la anécdota.[19] Time eligió la frase como uno de los diez gazapos de políticos del año.[20]
El 9 de septiembre de 2014 anunció su intención de no concurrir a las urnas en las elecciones municipales de 2015.[21]
En diciembre de 2018, fue condenada provisionalmente (junto a otros exconcejales del Partido Popular) por el Tribunal de Cuentas al pago de 2,8 millones de euros por la venta irregular en octubre de 2013 de 1860 viviendas públicas de la Empresa Municipal de la Vivienda y Suelo (EMVS) al fondo buitreBlackstone.[23][24] El Tribunal de Cuentas la absolvió en julio de 2019.[25] En enero del año 2019 también la causa penal fue archivada por el Juzgado de Instrucción Número 38 de Madrid.[26]
Sánchez, Inmaculada (3 de febrero de 2003). «Los Botella». El Siglo de Europa (541). Archivado desde el original el 16 de marzo de 2018. Consultado el 15 de marzo de 2018.