Der Sohn eines Getreidehändlers studierte nach dem Schulabschluss zunächst ein Jahr Medizin. Danach nahm er ein Studium der Rechtswissenschaften auf, während dessen er im Studententheater erste Schauspielerfahrungen machte. Nach erfolgtem Examen und anschließender Promotion zum Doktor der Rechte verlagerte Mezzogiorno seinen beruflichen Schwerpunkt ganz auf das Schauspiel. Am Theater spielte er unter der Regie von Eduardo De Filippo in dessen Compagnia. Er trat an der Seite von berühmten Kollegen wie Aldo Giuffrè und Carlo Giuffrè in Stücken von Aristophanes, Bert Brecht und Eugène Ionesco auf. Im Ensemble von Peter BrooksLe Mahabharata, einem zehnstündigen Epos über die indische Mythologie, ging Mezzogiorno in der Rolle des Halbgottes Arjuna zwei Jahre auf Welttournee und gab Gastspiele beim Festival von Avignon (1985), der Royal Shakespeare Company, in Paris, Athen, Barcelona, Madrid, Lyon, Zürich, Los Angeles, New York, Perth, Adelaide, Kopenhagen, Glasgow und Tokio.
Bereits 1963 gab er unter der Regie von Leonardo Cortese in einer Adaption von Alexandre DumasLuisa Sanfelice sein Fernsehdebüt. In den folgenden drei Jahrzehnten spielte Mezzogiorno in zahlreichen von Filmkritik und Publikum beachteten Fernsehproduktionen, wie 1979 in der mehrteiligen Verfilmung von Jack LondonsMartin Eden, als Mussolinis Vertrauter Alessandro Pavolini im Drama Ich und der Duce (mit Bob Hoskins als „Duce“) und in den ersten drei Teilen des aufwändig inszenierten Historienfilms Die Französische Revolution, in dem er Jean-Paul Marat als kompromisslosen Fanatiker zeichnete. Auch in der mehrteiligen Umsetzung von Peter BrooksMahabharata (Das Würfelspiel/Der Krieg/Die Verbannung) war Mezzogiorno wieder mit von der Partie. Wenngleich er bereits 1965 in vier Folgen der Fernsehserie Le avventure di Laura Storm zu sehen war, blieben Auftritte in Fernsehserien rar. Die erste und zugleich einzige größere Serienrolle erhöhte allerdings seinen internationalen Bekanntheitsgrad: 1990 trat er die Nachfolge des von Michele Placido verkörperten „Corrado Cattani“ als furchtloser und unerbittlicher Ermittler in der 5. Staffel der erfolgreichen Produktion Allein gegen die Mafia an. Die Hauptrolle des „Commissario Davide Licata“ sollte zugleich seine letzte berufliche Tätigkeit werden: In der 6. Staffel starb der Mafia-Jäger den Serientod.
Am 14. Oktober 1972 heiratete Mezzogiorno seine Kollegin Cecilia Sacchi. Aus der Ehe gingen zwei Kinder hervor. Seine Tochter, Giovanna Mezzogiorno, arbeitet ebenfalls als Schauspielerin. 1993 musste sich Mezzogiorno wegen einer Krebserkrankung behandeln lassen. Am 7. Januar 1994 starb er im Alter von nur 52 Jahren in Mailand nach einem Herzanfall.
Filmografie (Auswahl)
1963: Luisa Sanfelice (Fernsehfilm)
1965: Le avventure di Laura Storm (Fernsehfilm)
1975: La Cecilia (Fernsehfilm)
1975: Il marsigliese (Fernsehserie)
1976: Die letzte Rechnung schreibt der Tod (Milano violenta)
1976: La Orca – Gefangen, geschändet, erniedrigt (La orca)