Zurückgekehrt in seine Heimatstadt wurde er 1686 außerordentlicher Professor der hebräischen Sprache und Geographie an der Tübinger Hochschule. 1688 übernahm er die ordentliche Professur der griechischen Sprache und Philosophie, betätigte sich als Unterhändler im Krieg von 1688 und wurde aufgrund seines dort angewendeten Geschicks beim Schutz von Tübingen und Stuttgart 1690 zum geheimen Kriegsrat ernannt. 1692 wurde Ephorus des theologischen Stifts in Tübingen, 1697 Prälat von Königsbronn und 1699 Prälat von Hirsau mit Sitz in Tübingen.
Osiander erhielt 1703 von August von Polen und Sachsen den Titel eine Konsistorialrats und wurde von Karl XII. von Schweden zum Kirchenrat ernannt. 1708 wurde er von Herzog Eberhard Ludwig zum Konsistorialassessor in Stuttgart berufen, womit ihm die Leitung der gesamten württembergischen Kirchen und Schulen übertragen wurde. Nachdem er sich auch an diplomatischen Missionen in Dänemark, Schweden, Polen, Preußen, Italien und England beteiligt hatte, wurde er 1713 wirklicher Geheimrat und zog er sich in seinen letzten Lebensjahren auf sein Landgut zurück. Besonderes Verdienst um die württembergische Landeskirche hatte er sich mit der Einführung der Konfirmation 1722/23 erworben.
Friedrich Wilhelm Schmidt: Johannes Osiander, eine Volksschrift, worin erzählet wird von einem würtembergischen Magister. Fues, Tübingen 1843 (Digitalisat).
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